基于蒙特卡羅模擬技術的食用菌中二氧化硫膳食暴露風險評估

李曉貝，趙曉燕*，劉海燕，周昌艷，范婷婷，張艷梅

（農業農村部食用菌產品質量監督檢驗測試中心（上海），上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403）

食用菌因其鮮美滋味及豐富營養廣受歡迎，目前已成為我國僅次于糧、油、果、菜的第五大農作物[1]。根據中國食用菌協會統計，2012—2017年我國食用菌總產量呈逐年遞增趨勢，由2 828萬 t增長至3 712萬 t，出口量則相對穩定，為50.7萬～63.1萬 t，無明顯遞增或遞降趨勢[2-4]。二氧化硫在國內外食品加工業中均有應用，具有防腐、抗氧化、護色等功能，在食用菌工業生產中主要有兩個來源，一是燃煤干制或硫磺熏蒸過程中與氧氣結合形成，二是亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽等離解產生。但是二氧化硫及其衍生產物焦亞硫酸鹽、亞硫酸鹽等的過量攝入對人體有害，急性接觸對眼睛、黏膜、皮膚等有刺激作用，長期慢性攝入對人體呼吸系統、生殖系統、消化系統等都會造成一定危害，還有一定致癌作用[5-7]。世界各國對食用菌或相關食品中的二氧化硫制定了最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）值：食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）規定新鮮、冷凍及罐裝/袋裝食用菌中二氧化硫MRL為50 mg/kg，干制及發酵食用菌中二氧化硫MRL為500 mg/kg[8]；日本對食用菌中二氧化硫限量為30 mg/kg[9]；美國食品藥品監督管理局規定，當食品中亞硫酸鹽含量超過10 mg/kg時，需注明本食品含有亞硫酸鹽[10]；我國GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》規定干制食用菌及蘑菇罐頭中二氧化硫MRL值為50 mg/kg，經表面熏蒸處理的鮮食用菌二氧化硫MRL值為400 mg/kg[11]。

近年來，食用菌中二氧化硫殘留問題一直引人關注。平華等[12]對北京、河北地區的食用菌調查結果顯示干香菇二氧化硫超標率為40.0%，平均檢出值為48.9 mg/kg，最大檢出值為195.0 mg/kg。我國作為食用菌國際貿易大國在出口過程中也經常受到二氧化硫困擾，2011—2018年我國食用菌出口受到歐盟、日本、韓國扣留或召回共88 批次，其中因二氧化硫或硫酸鹽超標引起的占28.4%[13]。然而，國內對于食用菌中二氧化硫殘留量相關研究多是關注檢出值、超標率等問題，且涉及的品種也相對較少，缺乏系統性的風險評估。傳統的膳食暴露評估在進行風險描述時通常采用固定的暴露參數，評估結果可能會偏高或者偏低。蒙特卡羅（Monte Carlo）模擬方法則是一種概率評估法，通過對風險變量的隨機抽樣模擬計算風險概率分布，可以更好地反映風險分布的真實情況。Monte Carlo模擬技術在系統科學、信息學、物理學、環境科學、金融工程學、生物醫學等各領域取得了廣泛且成功的應用[14-18]。在食品安全領域，已有研究通過Monte Carlo模擬技術對人參中二氧化硫[19]、米糕中微生物[20]、水產品中甲醛[21]等膳食暴露風險進行了評估，并提出了相應的風險控制建議。

根據食用菌協會的統計結果，我國食用菌產量連續多年排名前7的品種是香菇、黑木耳、平菇、雙孢蘑菇、金針菇、毛木耳及杏鮑菇，年產量均超過100萬 t，這7 種食用菌是我國的主要栽培品種，2012年以來每年合計產量均占當年全國食用菌總產量的80%以上，牛肝菌、草菇、茶樹菇、真姬菇也是我國產量相對較高的特色食用菌品種[3-4]。基于此，本研究對我國主要消費的10 種食用菌中二氧化硫的殘留量進行調查分析，并利用基于Monte Carlo模擬技術的@Risk軟件對食用菌中二氧化硫的膳食暴露風險進行評估，以期了解我國食用菌中二氧化硫的殘留分布及健康膳食風險，為食用菌的質量安全管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表1 食用菌種類及數量統計Table 1 Species of edible fungi and number of samples from each species

樣品為2012—2015年上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所連續承擔全國食用菌風險評估任務采集的樣本，包括市場和生產基地兩個環節，來自我國北京市、天津市、上海市、重慶市、河北省、山西省、遼寧省、吉林省、黑龍江省、江蘇省、浙江省、福建省、江西省、山東省、河南省、湖北省、湖南省、廣東省、海南省、四川省、貴州省、云南省、陜西省、甘肅省、青海省、內蒙古自治區、廣西壯族自治區、寧夏回族自治區、新疆維吾爾自治區等29 個省級行政區域，包括香菇、木耳、金針菇、平菇、雙孢蘑菇、銀耳、茶樹菇、牛肝菌、真姬菇、草菇10 種我國主要消費食用菌品種，其中10 種新鮮食用菌共1 502 個，5 種干制食用菌（包括香菇、木耳、銀耳、茶樹菇及牛肝菌）共763 個，共計2 265 個樣品，詳見表1。干制樣品粉碎過篩后陰涼干燥處貯存，新鮮樣品勻漿后-20 ℃冰箱冷凍保存，當年樣品當年檢測。

鹽酸、可溶性淀粉、乙酸鉛、硫代硫酸鈉、碘、碘化鉀等，均為國產化學純。

1.2 二氧化硫含量測定

根據風險評估項目要求，以GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸鹽的測定》[22]中的第二法“蒸餾法”對食用菌中的二氧化硫殘留量進行檢測。在密閉容器中對勻漿/粉碎的食用菌樣品進行酸化并加熱蒸餾，將釋放出的二氧化硫通過乙酸鉛溶液吸收，吸收后用濃酸酸化，再以碘標準溶液滴定，根據所消耗的碘標準溶液計算出所測食用菌樣品的二氧化硫含量。方法檢出限（limit of detection，LOD）測定參照國標方法，為3.0 mg/kg。現行檢測標準方法GB/T 5009.34—2016《食品中二氧化硫的測定》僅保留了蒸餾法，刪除了第一法“鹽酸副玫瑰苯胺法”，經比對后技術路線無實質性改變[23]。

1.3 風險評估

1.3.1 風險描述公式

應用風險商對食用菌中二氧化硫殘留量進行風險描述，以二氧化硫每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為標準進行評價，通過接觸人群的二氧化硫膳食暴露量與二氧化硫ADI計算風險商[24-25]，以表征經食用菌途徑攝入二氧化硫的風險大小，當風險商低于1時，表示沒有風險；當風險商高于1時，表明有風險，且數值越大，風險也越大。計算如下式所示：

“這是誰都勉強不了的事情！”汪隊長拍拍頭，面露難色，“這也不是你我說了算的事情，也不是你那個陳班長一廂情愿的事情，關鍵是要讓李曉英心甘情愿才成！”

式中：HQ為風險商；EED為新鮮食用菌和干制食用菌攝入后的二氧化硫日體質量暴露量之和/（mg/（kg·d））；Ci為新鮮或干制食用菌中二氧化硫的殘留量/（mg/kg）；Fi為新鮮或干制食用菌的日體質量攝入量/（kg/d）；A為腸胃對二氧化硫的吸收系數；E為食用食用菌的年暴露頻率/（d/a）；D為食用食用菌的暴露持續時間/a；T為拉平時間/d；ADI為每日允許攝入量/（mg/（kg·d））。

1.3.2 風險評估數據來源

1.3.2.1 食用菌中二氧化硫殘留量

將未檢出的樣品統一賦值1/2LOD[26-27]，即1.5 mg/kg。將未檢出樣品賦值后，運用@Risk5.7軟件將食用菌中二氧化硫殘留值進行分布擬合，函數曲線的擬合度運用卡方、安德森-達林和科二莫戈羅夫-斯米爾諾夫3 種統計檢驗方法進行檢驗，以最佳擬合分布為最終分布函數[28]。隨機從不同品種或不同樣品類型的食用菌二氧化硫殘留量分布函數中抽取數值計算風險概率。

1.3.2.2 食用菌日體質量攝入量

引用邵祥龍等[29]的2009年上海市居民食用菌消費數據，如表2所示。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）和聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization，FAO）聯合發起的全球環境監測規劃-食品污染物監測計劃（GEMS/food）最新發布的數據中19 大類共62 小類食品中未將食用菌單獨列出[30]，國內外相關文獻分別列出新鮮及干制食用菌消費量且最接近本研究執行時間（2012—2015年）的為邵祥龍等[29]的研究數據。孔雷等[31]研究顯示：收入越高的人群食用菌的消費量越大，上海市居民平均收入水平居全國前列，其食用菌消費水平應不低于中國居民平均消費水平，基于風險最大原則，可作為食用菌膳食消費量的參考值。

表2 上海市居民食用菌日體質量消費量Table 2 Daily consumption of edible fungi of ordinary residents in Shanghai

1.3.2.3 二氧化硫腸道吸收系數

二氧化硫易溶于水，可看成食用菌中的二氧化硫在腸道中可完全吸收，即腸道吸收系數為1[32]。

參照美國環境保護署風險分析手冊中相關數據，暴露頻率為常數350 d/a，終生持續暴露時間為70 a[33]。

1.3.2.5 拉平時間

拉平時間為70×365 d=25 550 d。

1.3.2.6 二氧化硫ADI

采用FAO/WHO食品添加劑專家委員會的數據，二氧化硫ADI值以體質量計算，為0～0.7 mg/（kg·d）[34]。

1.4 數據分析

將10 種新鮮食用菌及5 種干制食用菌的二氧化硫殘留量依品種進行匯總，分別由IBM SPSS Statistics 19軟件通過單因素方差分析進行顯著性分析，分析方法為Duncan多重檢驗，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同食用菌中二氧化硫殘留量分析

本研究對我國主要消費的10 種共1 502 批次新鮮食用菌及5 種763 批次干制食用菌樣品中二氧化硫殘留狀況進行分析。不同食用菌中二氧化硫殘留結果如表3所示。結果顯示，10 種共1 502 批次新鮮食用菌二氧化硫平均殘留量為2.94 mg/kg，最大檢出值為142.00 mg/kg（雙孢蘑菇），低于GB 2760—2014規定的經表面熏蒸處理的鮮食用菌二氧化硫MRL值（400 mg/kg），無超標現象。其中新鮮草菇和銀耳均未檢出二氧化硫，其余8 種新鮮食用菌二氧化硫平均殘留量為1.71～5.07 mg/kg，無顯著差異（P＞0.05）。5 種763 批次干制食用菌二氧化硫平均殘留量為43.70 mg/kg，最大檢出值為3 380.00 mg/kg（銀耳），部分高于GB 2760—2014規定的干制食用菌中二氧化硫的MRL值（50 mg/kg），總體超標率為8.9%。其中干制銀耳二氧化硫平均殘留量（208.80 mg/kg）顯著高于其他4 種干制食用菌，其次是香菇（51.46 mg/kg），茶樹菇、木耳、牛肝菌二氧化硫平均殘留量無顯著差異（P＞0.05）。除牛肝菌外其余4 種干制食用菌均存在超標情況，超標率由高至低為銀耳（19.1%）、香菇（18.8%）、茶樹菇（9.7%）、木耳（1.5%）。整體而言，干制食用菌二氧化硫殘留及超標情況遠超于新鮮食用菌，尤以香菇及銀耳為甚。

表3 不同食用菌中二氧化硫殘留量Table 3 Concentrations of sulfur dioxide residue in different species of edible fungi

有監測結果[35-36]顯示：筍干、干黃花菜、干竹筍、干銀耳等干制蔬菜的二氧化硫超標率均在30%以上，是日常通過膳食攝入二氧化硫的重要來源。鮮銀耳中未檢出二氧化硫，干銀耳的高二氧化硫殘留可能主要源自烘干工藝，需持續關注并加強其殘留監管力度。相關研究表明外源引入的亞硫酸鹽或者二氧化硫并非香菇中二氧化硫的唯一來源，香菇的特征風味物質為多種揮發性含硫雜環化合物，這些化合物在干香菇中的總含量在200 mg/kg以上，甚至可高達4 770 mg/kg，且顯著高于鮮香菇中含量[37-38]。此類含硫化合物在使用蒸餾法測定的過程中可部分轉化為二氧化硫，從而使得測量值偏高，因此干香菇中二氧化硫的殘留可能由內源代謝物產生，不一定是外源添加，應對香菇及其他含硫食品開發針對外源二氧化硫的測定方法。此外，GB 2760—2014未直接規定新鮮食用菌中二氧化硫限量值，僅制定了經表面熏蒸處理的鮮食用菌二氧化硫MRL值為400 mg/kg，雖然按照此標準新鮮食用菌不存在超標狀況，但是無法判斷所采集的新鮮食用菌是否經由硫磺熏蒸，參照CAC（50 mg/kg）及日本（30 mg/kg）的限量值，木耳、平菇、雙孢蘑菇及牛肝菌存在一定超標情況，不利于我國食用菌的出口貿易發展，應盡快制定更為精細的新鮮食用菌中二氧化硫的限量標準。

2.2 不同食用菌中二氧化硫殘留量模擬分布比較分析

表3顯示各種食用菌二氧化硫殘留值的標準偏差均極大，尤其干香菇、干木耳等極值較大的品種，由平均值計算而得的95%置信區間殘留量與實際殘留量分布偏差較大。本研究使用基于Monte Carlo模擬技術的@Risk5.7軟件，對這10 種常見食用菌的二氧化硫殘留量分布進行模擬（對于未檢出的樣品統一賦值1.5 mg/kg），每次模擬過程循環10 000 次，不同品種食用菌中二氧化硫的殘留量分布如圖1所示。模擬分布所得的各食用菌二氧化硫殘留量多數符合指數分布，呈現低殘留集中、存在部分極值的分布狀態。圖1a顯示新鮮食用菌中，木耳的二氧化硫殘留量整體顯著高于其他9 種食用菌，金針菇、真姬菇、銀耳、草菇二氧化硫殘留量顯著低于其他食用菌。圖1b顯示干制食用菌中，銀耳與木耳二氧化硫高殘留現象突出，木耳、茶樹菇及牛肝菌整體殘留水平相對較低。各食用菌模擬平均殘留量與實際平均殘留量接近，殘留量分布區間更接近真實分布狀況。

圖1 基于Monte Carlo模擬的不同品種食用菌二氧化硫殘留量分布Fig. 1 Simulated distribution of sulfur dioxide residue in various edible fungi based on Monte Carlo simulation

2.3 食用菌中二氧化硫膳食暴露風險評估

利用@Risk5.7軟件對1 502 個新鮮食用菌及763 個干制食用菌的二氧化硫殘留量分布進行模擬，每次模擬過程循環10 000 次。模擬結果顯示新鮮食用菌的二氧化硫殘留量分布滿足指數分布（Expon），記為RiskExpon（1.434 6, RiskShift(1.499)），平均殘留量為2.93 mg/kg；干制食用菌的二氧化硫殘留量分布滿足指數分布，記為RiskExpon（42.206, RiskShift(1.444 7)），平均殘留量為43.64 mg/kg。將二氧化硫殘留量數據及其他相關暴露參數代入1.3.1節風險商公式，通過@Risk5.7軟件計算中國未成年及成年人經食用菌途徑攝入二氧化硫的風險概率分布，每次模擬過程循環10 000 次，所得結果如圖2所示。

圖2 普通居民經食用菌途徑攝入二氧化硫的風險商概率分布Fig. 2 Hazard quotient probability distribution of sulfur dioxide by dietary consumption of edible fungi to general residents

中國未成年人群及成年人群經食用菌途徑攝入二氧化硫的風險商平均值分別為0.008 4及0.006 4，97.5%位點的高暴露水平下風險商分別為0.026 7及0.020 8，未成年人群略高于成年人群，但均遠小于1，不存在膳食暴露風險。徐為霞等[36]研究顯示河南鄭州市銀耳風險商為5.34，遠高于本研究所得結果，主要因為其評估所引用銀耳日膳食消費量為蔬菜總體消費量（0.28 kg/d），約為本研究引用數據中成人新鮮食用菌消費量的18 倍，干制食用菌消費量的51 倍，且其所監測銀耳樣品二氧化硫平均殘留量約為本研究相應平均殘留量的4 倍，屬于極端消費情況。本研究引用的消費數據雖然為2009年的調查結果，但是仍具有一定代表性。2002年后我國食用菌進口量一直遠低于出口量，食用菌產出主要用于滿足國內消費需求，2011年后產量增速放緩，至2014年食用菌總產量約為2009年的1.3 倍[31]，假設我國普通居民食用菌日平均消費量隨總產量等比增長，風險商增加1.3 倍后最大值為0.009 5，仍遠低于1，通過食用菌攝入二氧化硫的風險仍然很低。

風險評估具有一定不確定性，在本研究中主要體現在4 個方面：一是所引用食用菌平均消費量非全國居民膳食消費調查結果，膳食調查時間亦早于本研究進行階段，且無具體食用菌膳食消費分布數據，無法評估不同地區、不同人群、不同品種及極端消費情況下的二氧化硫攝入風險；二是暴露頻率、暴露時間等數據引用自美國環境保護署，且未考慮清洗、烹調等加工因子，缺乏中國人群的真實暴露信息；三是所用二氧化硫殘留量檢測方法無法區分內源含硫物質及外源添加含硫物，測定結果可能會偏高，從而導致評估風險商偏高；四是本研究僅以食用菌為單一的二氧化硫暴露途徑，而居民日常還會通過攝入其他蔬菜、水果以及環境污染等多種途徑接觸二氧化硫，對居民整體的二氧化硫暴露風險評估仍存在一定局限性。今后的相關研究應加強膳食消費數據的調查及全膳食評估的綜合評價。

2.4 不同人群攝入二氧化硫的風險比較分析

圖3 不同人群經新鮮食用菌及干制食用菌攝入二氧化硫的風險比較Fig. 3 Comparation of hazard quotient of sulfur dioxide by dietary consumption of fresh and dried edible fungi to different populations

依據1.3.1節風險商公式，利用@Risk5.7軟件分別計算中國未成年及成年人群經新鮮食用菌及干制食用菌途徑攝入二氧化硫的風險概率分布，每次模擬過程循環10 000 次，所得結果如圖3及表4所示。圖3顯示，約在10%位點后，普通居民經干制食用菌途徑攝入二氧化硫的風險商各位點值均遠高于新鮮食用菌，且對于兩類食用菌未成年人群的二氧化硫膳食攝入風險商均略高于成年人。表4顯示，未成年人群經新鮮食用菌及干制食用菌途徑攝入二氧化硫的風險商平均值分別為0.001 3及0.007 0，高暴露百分位點下干制食用菌途徑攝入二氧化硫的風險商高出新鮮食用1 個數量級，可以看出經新鮮食用菌途徑攝入二氧化硫的風險遠低于干制食用菌。成年人群情況相似。本研究引用的膳食消費數據中居民新鮮食用菌攝入量約為干制食用菌的3 倍，但是干制食用菌中二氧化硫殘留量平均值約為新鮮食用菌的15 倍，因此干制食用菌的高二氧化硫殘留量決定了其為通過食用菌攝入二氧化硫的主要途徑。注：a.P50為50百分位數，即把變量值按大小順序排列，居于全部變量個數的50%位置的數值。P95及P97.5同理。

表4 不同人群經新鮮食用菌及干制食用菌攝入二氧化硫的風險商統計Table 4 Summary of statistical data of hazard quotient of sulfur dioxide by dietary consumption of fresh and dried edible fungi to different populations

3 結 論

我國干制食用菌二氧化硫殘留及超標情況遠超于新鮮食用菌，新鮮及干制食用菌中二氧化硫平均殘留量分別為2.94 mg/kg及43.70 mg/kg，銀耳、香菇、茶樹菇等干制食用菌存在超標風險，銀耳與香菇二氧化硫高殘留現象較為突出，需持續關注。然而，中國普通居民經食用菌途徑攝入二氧化硫的風險較低，且經新鮮食用菌途徑攝入二氧化硫的風險顯著低于干制食用菌，經新鮮及干制食用菌途徑攝入二氧化硫的風險商在各百分位點均遠低于1，最大值為0.007 3。其中未成年人群經食用菌途徑攝入二氧化硫的風險略高于成年人，但無顯著差異。干制食用菌的高二氧化硫殘留量決定了其為通過食用菌攝入二氧化硫的主要途徑。研究結果為我國食用菌的質量安全管理提供了科學依據。