基于網(wǎng)絡藥理學探討柴胡三參湯治療缺血性心律失常的作用機制

冉俊寧，馮君，黃巍，唐聰聰，劉慧慧，王偉松，劉建和*

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

心律失常是心臟起搏和傳導功能紊亂而發(fā)生的心臟節(jié)律、頻率或激動順序異常[1]。研究表明，約有90%急性心肌梗死的患者出現(xiàn)不同程度的心律失常，而急性心肌梗死的發(fā)病率隨著老齡化、生活習慣改變、社會心理等諸多因素的影響呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2-3]。缺血性心律失常(ischemic arrhythmias,IA)是冠心病比較常見的并發(fā)癥，是心源性猝死發(fā)生的重要原因，發(fā)病率高，嚴重威脅著人類的健康[4-5]。

網(wǎng)絡藥理學以系統(tǒng)生物學、藥物生物化學及多向藥理學為理論基礎，通過構建藥物、靶點、通路、疾病的相互網(wǎng)絡來探討藥物的作用機制[6-7]。中藥治療疾病具有多活性成分、多靶點、整體調(diào)節(jié)的特點，將網(wǎng)絡藥理學運用于中藥作用機制的研究，有利于了解中藥治病的整體性和系統(tǒng)性[8]。

缺血性心律失常屬于中醫(yī)“心悸”的范疇，基本病機為少陽不和,治法主要為和解定悸[9]。柴胡三參湯是導師劉建和教授其師在小柴胡湯基礎上加減而來的，全方合用共奏和解定悸、清心活血、益氣化痰之功效，臨床運用于缺血性心律失常的治療，療效顯著[10]，其機制可能是柴胡三參湯多靶點、多通路共同作用的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 柴胡三參湯活性成分篩選

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺[11](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)是一種獨特的中草藥系統(tǒng)藥理學平臺，它能捕捉藥物、靶標和疾病之間的關系。本研究通過在TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)平臺分別輸入柴胡三參湯中柴胡、黃芩、半夏、丹參、苦參、黨參、青蒿、甘草8味藥物檢索其活性成分，并對活性成分進行篩選，篩選標準為：口服利用度(OB)>30%，藥物相似性(DL)>0.18[12]。將同時滿足OB>30%、DL>0.18的活性成分篩選出來，作為候選活性成分。

1.2 活性成分靶點的預測

將候選的活性成分的名稱輸入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫平臺，獲得各活性成分的化學結(jié)構式，無法在PubChem獲得化學結(jié)構式的活性成分則剔除，分別將各活性成分的化學結(jié)構式輸入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，即可得到各活性成分的靶點信息，無法在Swiss Target Prediction預測到的活性成分也剔除，整理所獲得的靶點，刪除重復的靶點[13-14]。

1.3 缺血性心律失常疾病靶標的收集

通過GeneCards[15](https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫對缺血性心律失常的英文名稱ischemic arrhythmias進行檢索,即可得到缺血性心律失常的靶點信息，將靶點信息導入Excel2016進行處理，設定篩選標準為Relevance score>10,即可得到缺血性心律失常的疾病靶標。

1.4 共同靶點篩選

利用在線作圖平臺(http://bioinfo.genotoul.fr/jvenn/example.html)將柴胡三參湯活性成分的靶點與缺血性心律失常疾病靶點進行映射構建韋恩圖，分別以CHSS、IA表示柴胡三參湯、缺血性心律失常，得到共同靶點，這些靶點可能是柴胡三參湯治療缺血性心律失常的關鍵靶點。

1.5 構建蛋白互作網(wǎng)絡

將獲得的共同靶點導入STRING[16](https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple proteins，限定物種為Homo sapiens，進行共同靶基因間的蛋白互作網(wǎng)絡分析，各蛋白相互作用的信息在數(shù)據(jù)庫中以置信度分值表示，置信度0.4以上表示有互作關系，故設定置信度為中等(medium confidence>0.4)，其他參數(shù)不變，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(PPI，protein-protein interaction)。并將node1、node2、Combined score 值導出，運用Cytoscape3.7.1軟件得到各靶點的degree值，將其導出在Excel2016繪制簇狀條形圖。

1.6 共同靶點GO功能注釋和KEGG富集分析

運用Cytoscape3.7.1軟件中的插件ClueGo[17]對篩選出的共同靶基因進行GO生物學功能注釋，對共同靶點進行富集分析，保留P≤0.05的結(jié)果，并對圖形進行可視化處理，分析柴胡三參湯治療缺血性心律失常可能的生物過程。同時將共同的靶點文件導入DAVID[18](https://david.ncifcrf.gov/)進行KEGG通路富集分析，設定篩選篩選條件為P<0.05、Count=2，得到分析結(jié)果,將KEGG通路富集分析結(jié)果導出在Excel2016進行數(shù)據(jù)處理，并繪制KEGG通路簇狀條形圖，然后將處理好的數(shù)據(jù)在imageGP[19](http://www.ehbio.com)在線平臺上進行分析，作出KEGG通路富集氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 柴胡三參湯活性成分信息

該研究在TCMSP平臺，運用篩選標準，共得到活性成分311種，刪除重復活性成分27種、在PubChem未搜索到化學結(jié)構式及在Swiss Target Prediction未預測到靶點的活性成分69種后，得到柴胡三參湯八味中藥215種活性成分，其中半夏12種、柴胡14種、丹參38種、黨參13種、甘草74種、黃芩27種、苦參26種、青蒿11種。

2.2 活性成分靶點預測

將215種柴胡三參湯的活性成分在PubChem獲得化學結(jié)構式，并在Swiss Target Prediction進行靶點預測，共得到靶點23 884個，去重后得到柴胡三參湯活性成分相關靶點1 319個。

2.3 缺血性心律失常疾病靶點的獲得

在GeneCards數(shù)據(jù)庫平臺對缺血性心律失常(ischemic arrhythmias)的疾病靶點進行檢索，運用篩選標準后，共獲得120個相關靶標。

2.4 共同靶點的獲取

將缺血性心律失常的120個疾病相關靶點與柴胡三參湯活性成分的1 319個靶點輸入在線作圖平臺繪制韋恩圖(圖1)，其中IA代表缺血性心律失常，CHSS代表柴胡三參湯，兩類靶點取交集后即可的到疾病-活性成分共同靶點43個，此即是柴胡三參湯治療缺血性心律失常有重要意義的靶點。

圖1 缺血性心律失常靶點與柴胡三參湯成分靶點韋恩圖

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡的構建及核心靶點的篩選

運用STRING數(shù)據(jù)平臺分析輸入的43個共同靶點后得到蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)，共獲得相互作用節(jié)點43個和相互作用關系370條，具體見圖2。并將STRING數(shù)據(jù)平臺中得到的結(jié)果node1、node2、Combined score 值導出，運用Cytoscape3.7.1軟件計算出每個靶點的degree，將結(jié)果導出到Excel2016，將degree值的前20繪制成簇狀條形圖(圖3)，通過degree值測算出柴胡三參湯治療缺血性心律失常的重要靶標，分別為白蛋白(ALB)、白細胞介素-6(IL6)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、一氧化氮合成酶3(NOS3)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管緊張素1轉(zhuǎn)化酶(ACE)、Serpin家族E成員1(SERPINE1)、激肽原1(KNG1)等。

2.6 共同靶點GO生物功能注釋

運用Cytoscape3.7.1軟件中的插件ClueGo對缺血性心律失常與柴胡三參湯活性成分的43個共同靶點進行GO生物功能注釋，保留P<0.05的結(jié)果，進行可視化的處理，得到GO富集分析的網(wǎng)絡圖(圖略)和餅狀圖(圖4)，網(wǎng)絡圖中生物過程不同表示的顏色深淺不同，節(jié)點大小表示調(diào)控強弱，節(jié)點間連線表示相互作用。由圖可知共同靶點主要富集于活性氧代謝過程的積極調(diào)節(jié)(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)、調(diào)節(jié)血液凝固(regulation of blood coagulation)、調(diào)節(jié)血管直徑(regulation of blood vessel diameter)、調(diào)節(jié)血液循環(huán)(regulation of blood circulation)、一氧化氮生物合成過程的積極調(diào)節(jié)(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)等221個生物過程。表明柴胡三參湯主要通過調(diào)節(jié)活性氧代謝過程、血液凝固、血管直徑等生物過程來治療缺血性心律失常。

圖2 共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡

圖3 degree值前20的共同靶點簇狀條形圖

圖4 共同靶點GO生物功能注釋餅狀圖

2.7 共同靶點KEGG通路富集分析

運用DAVID對43個共同靶點進行KEGG通路富集分析，通過篩選標準，將分析結(jié)果導出到Excel2016進行數(shù)據(jù)的處理，繪制KEGG通路富集簇狀條形圖(圖5)，其中X軸表示neglog10Pvalue值，Y軸表示通路的名稱。然后在imageGP 在線平臺對Excel2016處理過的KEGG通路富集分析的數(shù)據(jù)進行分析，得到KEGG通路富集氣泡圖(圖6)，其中氣泡大小取決于Count值，顏色深淺取決于Pvalue值，X軸為關聯(lián)基因數(shù)與信號通路上總基因數(shù)的比值(Gene Ratio)，Y軸為通路名稱。由圖可知，共同靶點主要富集在補體和凝血級聯(lián)信號通路、肥厚性心肌病信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡信號通路、擴張型心肌病信號通路、癌癥信號通路等14個信號通路。

圖5 KEGG通路富集簇狀條形圖

圖6 KEGG通路富集氣泡圖

3 討論

柴胡三參湯具有和解少陽、養(yǎng)心定悸之功效，缺血性心律失常屬于中醫(yī)“心悸”的范疇，病機主要為少陽不和，故柴胡三參湯能夠在臨床有效的治療缺血性心律失常[20]。現(xiàn)代醫(yī)學的研究表明，柴胡具有抗炎、降血脂、解熱、抗腫瘤等作用[21-22]，黃芩有降壓、抗心律失常、抗炎、抗腫瘤、保肝等作用[23-25]，半夏具有抗炎、抗腫瘤、止嘔等作用[26]，丹參具有抗動脈粥樣硬化、抑制心肌肥厚、抗心肌缺血、抗心肌纖維化、抗心律失常等作用[27-28]，苦參具有抗心律失常、利尿、抗炎、調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)等作用[29]，黨參具有心血管保護、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[30-31]，青蒿具有抗瘧、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[32]，甘草具有降血脂、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[33]。盡管柴胡三參湯的各個藥物的現(xiàn)代藥理研究已經(jīng)較為明確，但是其治療缺血性心律失常的機制還尚不完全明確。

本研究通過degree值測算出柴胡三參湯治療缺血性心律失常的前8個重要靶標，分別為ALB、IL-6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1。ALB可影響營養(yǎng)代謝、組織液分布和底物轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)氧化還原電位、血漿膠體滲透壓，并介導對自由基和其他有害化學物質(zhì)的保護[34]。IL-6在免疫、組織再生和新陳代謝中均起作用，它的快速產(chǎn)生有助于宿主感染和組織損傷時的防御，但其過度合成或受體信號的失調(diào)與疾病病理有關[35]。AKT，又稱蛋白激酶B(PKB)，它可調(diào)節(jié)必需的細胞功能，如遷移、增殖、分化、凋亡和代謝等，并可影響各種促血管生成因子和抗血管生成因子的表達或活性，已經(jīng)提出Akt同種型Akt1是血管生成相關異常的治療靶標[36]。一氧化氮(NO)作為重要的血管擴張劑，在心血管穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，其中介體是由NOS1、NOS3、NOS2等合成的，其中NOS3是心血管系統(tǒng)中NO形成的最重要的亞型[37]。腫瘤壞死因子是一種多效細胞因子，在各種生理和病理條件下產(chǎn)生不同的刺激，它對T細胞、B細胞、樹突細胞發(fā)育起重要作用，同樣也是炎癥介質(zhì)和細胞凋亡誘導劑[38]。研究表明，ACE在調(diào)節(jié)血壓和電解質(zhì)液體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[39]。SERPINE1可抑制尿激酶型纖溶酶原(uPA)和組織型纖溶酶原激活物(tPA)，減少纖溶酶原向活性蛋白酶纖溶酶的轉(zhuǎn)化[40]。激肽原1是參與腎功能、血壓、心功能及炎癥調(diào)節(jié)的重要因子[41]。故柴胡三參湯主要通過對ALB、IL6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1等靶點的調(diào)節(jié)來達到治療缺血性心律失常的作用。

富集分析的結(jié)果表明，治療過程中主要的通路可能是鈣信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路等[42]。其中鈣信號通路[43]、Toll樣受體信號通路[42,44]、細胞凋亡信號通路[45]是在缺血性心律失常中起重要作用的通路。缺血性心律失常是冠心病比較常見的并發(fā)癥。研究表明，在早期激活mTOR信號通路可以促進內(nèi)皮細胞的增殖和更新，并修復其損傷，mTOR信號通路還可調(diào)節(jié)脂代謝和細胞自噬，故可發(fā)揮抗冠狀動脈粥樣硬化性和心律失常的作用[46]。VEGF可以促進生理性或病理性血管的新生，是重要的血管生成促進因子，通過降低或抑制VEGF的表達，可以減少血管新生，從而防治動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[47]。其中mTOR信號通路與VEGF信號通路又可相互影響[48]。本研究還發(fā)現(xiàn)柴胡三參湯治療缺血性心律失常主要與調(diào)節(jié)活性氧代謝過程、血液凝固、血管直徑、血液循環(huán)、一氧化氮生物合成過程等生物過程相關。心肌缺血再灌注損傷可導致各種心律失常，其與自由基增多密切相關，而活性氧與一氧化氮均屬于自由基，對于心肌缺血再灌注損傷防治的關鍵在于盡早恢復血流、清除自由基等[49]。故柴胡三參湯可能主要通過恢復心肌血流、清除自由基等機制來治療缺血性心律失常。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法，挖掘到柴胡三參湯215種活性成分及1 319個作用的靶點，缺血性心律失常疾病的靶點120個，藥物與疾病的共同的靶點43個，通過degree值測算、GO及KEGG富集分析，預測到柴胡三參湯可能是通過調(diào)控ALB、IL6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1等靶點，調(diào)節(jié)鈣，Toll樣受體，細胞凋亡，mTOR，VEGF等信號通路，從而發(fā)揮調(diào)控細胞凋亡、抑制炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)、恢復心肌血流、清除自由基等作用來治療缺血性心律失常。但由于各數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)、軟件功能的限制，應以該研究結(jié)果作為基礎或線索，運用實驗研究來對其作用機制進行進一步的論證。