16S rRNA測序探討嶺南濕證人群腸道菌群結構變化

宋佳堉，叢夢雨，巫柳岑，王術玲

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

廣東地處嶺南，氣候炎熱濕溫，四季長夏冬暖，吳又可《溫疫論》 中曾道：“南方卑濕之地，更遇久雨淋漓，時有感濕者。”清代廣東名醫何夢瑤于《醫碥·中濕》道：“嶺南地卑土薄，土薄則陽氣易泄，人居其地，腠理汗出，氣多上壅。地卑則潮濕特盛，晨夕昏霧，春夏淫雨，人多中濕……。”嶺南地區人們喜澡善泳，喜食生猛海鮮，長期濕悶的氣候和當地的生活飲食習俗影響著人們的脾胃運化功能[1-2]。濕邪綿綿久客體內，易困脾胃，遂成濕證體[3-4]。尤其每年三、四月份陰雨綿綿，濕證癥狀最為明顯，起床難，沒精神，身困體乏，納呆，四肢酸沉，大便粘滯不成形，舌苔白厚、黃膩、邊有齒痕[5]。廣東人習用具有祛濕、健脾、降火、清熱等功效的中藥煲湯或煮涼茶以緩解癥狀，調理濕證體質，比如葛根鯽魚湯、木棉花糖水等。根據中醫理論，濕證病因重在脾胃，胃腸道功能是濕證的主要病機[6]，大便溏薄或瀉泄是濕證體質的重要表現，而大便形狀與腸道菌有直接關系，因此推測濕證體質人群的腸道菌群結構可能存在一定的破壞[7]，故本文通過招募志愿者，利用16S rRNA擴增子測序[8-9]，研究濕證體質人群的腸道菌群組成。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采用問卷調查的方式，于2018年3月—2018年4月召集志愿者53名，性別不限，年齡19～25歲，BMI 19～26 kg/m2。志愿者經廣州中醫藥大學黎同明、高潔兩位教授的診斷并結合調查問卷的內容，分成健康對照組和濕證組。濕證人群的納入標準：主證為大便溏而不爽，身重肢倦[1,10]。正常對照組應無上述癥狀及其他任何不適。排除標準：近3個月內使用過抗生素；近1個月內服用過益生菌制劑(包括酸奶)；患有消化道疾病。經過診斷，符合標準者共29名，濕證組(簡稱M組)16名和正常組(簡稱C組)13名。本研究符合世界衛生組織《涉及人的生物醫學研究國際倫理準則》和世界醫學協會最新修訂的《赫爾辛基宣言》的相關規定。

1.2 糞便樣本的收集

志愿者按日常習慣排便后，立刻收集于冷凍保藏管中，置于醫用冰盒運回實驗室，放入-80℃冰箱待制樣送檢。收回樣本29個，其中編號為C7、C9、M4、M8、M9、M11、M13的志愿者采樣時操作不規范，故棄去，共剩余有效樣本22個。

1.3 樣品檢測與庫的建立

提取糞便樣本總DNA，使用Qubit法對樣品濃度進行精確定量檢測，合格后需建立文庫，構建目的擴增子(Amplicon)片段并回收。使用融合引物建庫方法，合成融合了目標序列引物和上機接頭、index等序列的引物，通過一步PCR擴增直接完成建庫，使用Agencourt AMPure XP磁珠進行純化并溶于Elution Buffer。樣品的合格檢測，總DNA提取質控，修飾末端融合引物并PCR擴增，測序文庫構建及 Illumina Miseq 平臺高通量測序由深圳華大基因科技服務有限公司進行。

1.4 數據分析

利用Illumina Miseq平臺對腸道菌群DNA進行高通量測序；上機數據經過數據過濾，濾除低質量的reads，剩余高質量的Clean data方可用于后期分析；通過reads之間的Overlap關系將reads拼接成Tags；在給定的相似度下將Tags聚成OTU，然后通過OTU與數據庫比對，對OTU進行物種注釋；基于OTU和物種注釋結果進行樣品物種復雜度分析以及組間物種差異分析。通過Alpha Diversity(α多樣性分析)，Beta Diversity(β多樣性分析)，等數據分析手段，最終得到糞便菌群的物種豐度信息。

2 結果

2.1 樣本測序數據分析

本項目入選的研究樣本共22個，其中對照組(Control)和濕證組各11個樣本。高通量焦磷酸測序共產生1 374 547條有效序列，其中對照組11個樣本獲得688 061條有效序列(平均每個樣品序列數為62 551±421)；11個濕證組樣本共獲得686 486條有效序列(平均每個樣品序列數為62 408±396)。[11]通過分析不同樣本OTU組成(97%相似性),可以反映樣本的差異和距離。如果兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品的組成越相似、差異越小。不同處理或不同環境間的樣本可能表現出分散和聚集的分布情況，從而可以判斷相同條件的樣本組成是否具有相似性。圖1為基于OTU豐度的PLS-DA 分析，可看出濕證組和對照組的組成差異較大。

圖1 基于OTU豐度的PLS-DA 分析圖

2.2 腸道微生物 α多樣性分析——微生物群落結構分析

利用獨立樣本t檢驗(雙側)對所有樣本有效序列的群落豐富度指數(species richness)和群落多樣性指數(species diversity)進行比較分析[12]，包括：Observed species、ace、 Chao、Shannon和Simpson等5個指數。如表1所示，反映群落豐富度的Observed species，ace和Chao指數在濕證組顯著性高于對照組(P<0.05)；而反映群落多樣性的Shannon和Simpson指數在濕證組與對照組相比無差異。以上結果提示，濕證組比正常對照組的腸道菌群群落豐富度發生了顯著變化。

表1 濕證組和健康對照組α多樣性參數比較

注：*P<0.05，有統計學意義

2.3 腸道微生物 β 多樣性分析

β多樣性分析(β diversity)是用來比較物種多樣性方面存在的差異大小，本文采用unweighted UniFrac指數衡量β多樣性，利用該指數得到的分析圖中距離越大表示樣本間的差異越大。如圖2中的主坐標分析PCoA圖所示，除個別樣本存在偏差，濕證組和健康對照組基本呈現在不同區域。

圖2 β多樣性分析(物種多樣性)

2.4 門水平腸道菌群序列分類分析

腸道菌群大多數序列隸屬于Firmicutes(厚壁菌門)及Bacteroidetes(擬桿菌門)，這兩種菌門序列大約占總序列數90%以上，是腸道菌群中的絕對優勢菌群。本研究中，在門水平上，濕證組與健康對照組之間，腸道菌群物種豐度較高的擬桿菌門(Bacteroidetes，49.94% vs 45.09%)、厚壁菌門(Firmicutes，42.16% vs 45.75%)、變形菌門(Proteobacteria，6.87% vs 6.76%)、藍藻菌門(Cyanobacteria，0.12% vs 0.05%)、軟壁菌門(Tenericutes，0.04% vs 0.02%)、放線菌門(Actinobacteria，0.70% vs 1.10%)均未見顯著性差異。而與對照組相比，差異最明顯的是梭桿菌門(Fusobacteria，0.12% vs 0.89%) 濕證組降低了86.5%(P<0.05)。見圖3。

圖3 門水平物種差異圖

2.5 科水平腸道菌群物種組成分類分析

在科水平上，與對照組相比，差異最明顯的是普雷沃菌科(Paraprevotellaceae，2.08% vs 0.03%)，濕證組升高了近70倍(P<0.05)；此外，韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae，0.25% vs 0.95%)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae，0.56% vs 1.04%)，濕證組分別下降了73.95%、46.34%(P<0.05)。見圖4。

2.6 屬水平腸道菌群物種組成分類分析

濕證組與對照組相比共有6個屬差異顯著，分別是梭桿菌屬(Fusobacterium，0.07% vs 1.13 %)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium，0.56 % vs 1.04 %)，濕證組分別降低了93.76%、46.40%(P<0.05)；薩特氏菌屬(Sutterella，1.39% vs 0.82%)，顫螺旋菌屬(Oscillospira，1.01 % vs 0.64 %)，糞球菌屬(Coprococcus，1.93% vs 0.70 %)，丁酸亞胺菌屬(Butyricimonas，0.22% vs 0.07%)，濕證組分別升高了69.08%、58.19%、176.59%、200.78%(P<0.05)。見圖5。

圖4 科水平物種差異圖

圖5 屬水平物種差異圖

2.7 種水平上腸道菌群組成分析

與對照組相比，濕證組中的產蛋白酶嗜熱細菌(Anoxybacillus kestanbolensis)豐度顯著降低(P<0.05)；而口腔毛絨厭氧桿菌菌(Lachnoanaerobaculum orale)、嬰兒鏈球菌菌(Streptococcus infantis)、瘤胃乳桿菌(Lactobacillus ruminis)、產黑普氏菌(Prevotella melaninogenica)、淡黃奈瑟氏菌(Neisseria subflava)、牙髓卟啉單胞菌(Porphyromonas endodontalis)、粘滑羅氏菌(Rothia mucilaginosa)、齡齒羅氏菌(Rothia dentocariosa)在濕證組的豐度顯著升高(P<0.05)。見圖6。

圖6 種水平物種差異圖

2.8 PICRUSt腸道菌群功能預測分析

利用PICRUSt軟件對16S測序樣本中可能存在的各級KEGG通路及豐度值進行預測，共富集到81個功能通路[13]，其中濕證組有9條通路相對于正常對照組差異顯著(P<0.05)，見圖7，分別是：半胱氨酸和甲硫氨酸代謝(cysteine and mathionine metabolism)，能量代謝(energy metabolism)，葉酸生物合成(folate biosynthesis)，半乳糖代謝(galactose metabolism)，甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism)，脂多糖生物合成蛋白(lipopolysaccharide biosynthesis proteins)，氮代謝(nitrogen metabolism)，氧化磷酸化作用(oxidative phosphorylation)，五磷酸途徑(pentose phosphate pathway)。說明濕證體質引起的各種不適(如大便不爽，四肢酸沉等)可能與這些通路的功能異常有關。

圖7 差異通路圖

3 討論

本文對比了濕證體質志愿者與健康對照志愿者的腸道菌群組成，發現整體指標上，濕證組的群落豐富度指數與健康對照組顯著不同，而群落多樣性指數沒有差異，提示濕證組的腸道菌群中沒有形成新的菌種，只是有些細菌分布比例發生顯著改變。具體表現為濕證組的梭桿菌門(Fusobacteria)、韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)顯著降低，普雷沃菌科(Paraprevotellaceae)顯著升高；另外，還發現濕證組有6個屬、9個種的細菌分布與健康對照組顯著不同。此外我們利用PICRUSt軟件預測到這些腸道菌群的改變能引起11個通路的功能改變，提示這些功能的改變可能是濕質體質癥狀表現的誘因。

老火靚湯和涼茶是廣東最有特色的兩張名片，是千百年來人類與大自然抗 爭的結果，利用一些藥食同源的中藥材調理人體以適應環境、氣候等對健康的影響。歷來中醫古籍記載嶺南多疫瘴癘氣，這與濕溫的氣候導致空氣中微生物分布相比北方要多有關[14]。嶺南濕熱蘊蒸的氣候特點使長久生活于此的居民容易形成濕證體質，最常見的表現之一就是大便粘滯不爽，本文通過對濕證體質人群的腸道菌進行基因測序，發現與健康對照組相比，濕證組的腸道菌群結構存在顯著差異。而廣東人習用的煲湯藥材或凉茶或許是通過調節腸道微生態而改善濕證的癥狀[15]，這些推測仍需更深入的研究。