無創產前基因檢測診斷Pallister-Killian綜合征1例分析*

馮 暄，張 釧，張慶華，郝勝菊，鄭 雷，周秉博，王 興

(甘肅省婦幼保健院醫學遺傳中心，甘肅蘭州 730050)

Pallister-Killian綜合征(PKS)屬于染色體微缺失綜合征的一種，可導致患兒身體不同程度殘疾、生長發育遲緩或智力損傷等。PKS的臨床表現包括特征性顱面畸形、先天性心臟缺損、膈疝、癲癇和皮膚色素異常等[1]。PKS較為罕見，診斷困難，產前篩查是預防PKS患兒出生的有效手段[2]。本研究通過無創產前基因檢測(NIPT)診斷了1例PKS，現將結果報道如下。

1 臨床資料

孕婦，27歲，孕2產1，孕18周，否認近親婚配，無遺傳病家族史。于外院行超聲檢查提示：胎兒先天性膈疝，股骨、肱骨低于M-2SD線，心臟移位至右側胸腔，肺動脈主動脈比值增大，心包積液，三尖瓣反流(少量)。因血清學產前篩查18-三體綜合征高風險于本院就診，18-三體綜合征風險值為1/266。產科醫生咨詢后，建議直接行羊水穿刺產前診斷，但孕婦因擔心羊膜腔穿刺風險，自愿選擇NIPT，在充分了解NIPT的優勢與局限性后，簽署知情同意書，并于孕22周時進行檢測。

1.1NIPT 靜脈采集10 mL外周血，4 ℃下1 600×g離心10 min，取上清液2 mL分裝后再次于4 ℃下16 000×g離心10 min，獲得的血漿繼續進行游離DNA 提取，剩余標本于-80 ℃保存備用。標本DNA檢測合格后用PCR-free法進行文庫制備，采用NextSeq CN500高通量測序儀(貝瑞基因公司)完成36 bp的單端測序，檢測試劑盒為貝瑞基因公司生產的胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)，測序深度為0.3×，并進行生物信息學分析。NIPT結果提示：13、18、21-三體無異常，但存在12號染色體短臂部分重復dup(12)(p13.33-p11.1),Z值為20.81，起始位置為chr12:200000-34499999,片段大小為34.3 Mb，代表12號染色體短臂部分三體，見圖1，需行進一步的有創性診斷確診。

注：方框所示為染色體短臂重復部位，拷貝數為3。

圖1 NIPT 12號染色體拷貝數變異散點圖

1.2胎兒羊水細胞染色體核型分析 經產科醫生咨詢，簽署知情同意書后，于孕24周時行羊水穿刺。抽取羊水30 mL，取10 mL用于高通量測序,其余20 mL分2管，以2 000 r/min離心10 min后棄上清，取沉淀細胞，加適量羊水細胞培養基，接種于無菌培養瓶內，置于37 ℃、含5%二氧化碳的培養箱中靜置培養8～9 d，常規收獲制片。以G顯帶染色制備染色體標本，對每例標本均按照《人類細胞遺傳學國際命名體制(2013)》標準，計數20個中期分裂相細胞，分析5個核型。胎兒羊水細胞染色體核型分析結果：47，XX,+i(12)(p10)[58]/46,XX[42]，說明該標本為12號染色體短臂等臂染色體的嵌合體，見圖2。

1.3胎兒羊水高通量染色體拷貝數變異檢測(CNV-seq) 提取羊水基因組DNA，進行文庫構建：通過片段化-連接、PCR前純化、PCR擴增、PCR后純化等過程，采用 NextSeq CN500高通量測序儀(貝瑞基因公司)，進行CNV-seq，測序結果經貝瑞基因公司Enliven?變異注釋系統標注。CNV-seq結果為：dup(12)(p13.33-p11.1)(mos)，提示該標本12號染色體 p13.33-p11.1處檢測到拷貝數為3.5，片段大小為 34.70 Mb 的嵌合重復區域，起始位置為chr12:160001-34860000，見圖3、4。經查閱數據庫[包括Decipher數據庫、在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)、PubMed數據庫及UCSC Genome Browser數據庫]，得出該標本的變異包含了PKS的全部區域，結合羊水細胞染色體核型分析與CNV-seq的結果，該標本確診為PKS。

1.4孕婦及其配偶外周血染色體核型分析 為明確變異來源，對該孕婦及其配偶進行了外周血染色體核型分析，夫妻雙方G顯帶核型結果均未見異常，見圖5，說明胎兒染色體變異為新發。

注：胎兒染色體核型為47,XX,+i(12)(p10)；箭頭所示1個額外染色體，為12號染色體短臂等臂染色體。

圖2 胎兒羊水細胞染色體核型圖

注：方框所示為染色體拷貝數異常。

圖3 CNV-seq 12號染色體測序散點圖

注：A為12號染色體拷貝數變異測序圖，方框所示為染色體短臂重復部位，拷貝數為3.5；B為12號染色體，方框所示為12號染色體短臂重復部位示意圖。

圖4 CNV-seq 12號染色體拷貝數變異圖

注：A為孕婦外周血染色體核型：46,XX；B為孕婦配偶外周血染色體核型：46,XY。

圖5 孕婦及其配偶外周血染色體核型圖

2 討 論

PKS的細胞遺傳學特點是特定組織中以嵌合體形式存在的12號染色體短臂等臂染色體，故也稱為等臂12p綜合征或12p四體綜合征。PKS的嵌合效應是由于額外染色體上攜帶的基因最終導致顱面部、心血管、腎臟和其他系統異常。PKS可累及體內所有器官及系統，其典型臨床表現如下：(1)特殊面容包括皮膚色素異常、粗狂面容、眼距寬、高腭弓、前額突出、短頸等；(2)神經系統異常包括腦結構異常、癲癇、肌張力減退；(3)心臟缺陷包括心房和室間隔缺損；(4)胸部受累包括肺發育不全、膈疝；(5)胃腸道表現包括腸旋轉不良及肛門移位；(6)骨骼肌肉系統發育異常包括PKS特有的生長模式，即在宮內提示明顯的生長過度現象，但在出生后立即表現為生長發育遲緩；(7)75%的PKS患兒還有一定程度的視力損傷[2-3]。PKS胎兒在妊娠中期超聲檢查中可顯示出明顯的異常，包括羊水過多、膈疝、中樞神經系統異常、胎兒水腫、顏面部異常、心室擴張、短肢畸形等。當超聲檢查提示羊水過多、膈疝、肢根骨短小，尤其伴有生長過度時，應首先考慮PKS[4]。本研究中該孕婦妊娠中期超聲檢查提示：胎兒先天性膈疝，股骨、肱骨低于M-2SD線，心臟移位至右側胸腔，肺動脈主動脈比值增大，心包積液，三尖瓣反流(少量)。符合PKS超聲檢查的主要特征。

PKS具有特殊的細胞遺傳學特點，即異常的染色體有組織特異性，通常在皮膚成纖維細胞中可以檢測到異常。因此，由于嵌合體的組織特異性，PKS的診斷可能經常被遺漏，并且通常在快速分裂的細胞，如外周血淋巴細胞中不能檢測到[5-6]。已報道的病例中均未在外周血淋巴細胞中診斷出異常染色體i(12)(p10)[7]。據不同組織中期染色體核型分析統計，包含有異常染色體i(12)(p10)的組織包括：淋巴細胞(檢出率為0%～2%)、成纖維細胞(檢出率為50%～100%)、羊水細胞和骨髓細胞(檢出率均為100%)[8]。皮膚成纖維細胞中檢測嵌合體的成功率高于外周血，因為其異常細胞的損耗率低于T淋巴細胞[9]。本病例羊水細胞中i(12)(p10)檢出率為58%,說明CNV-seq技術可以精準地檢測出比例高于5%的嵌合體，也證明了在PKS的診斷方面，羊水細胞的檢出率較高。羊水CNV-seq結果顯示，12號染色體短臂重復，其拷貝數為3.5。一般來說，單純的染色體重復檢測到的拷貝數應為3，但該標本是12號染色體短臂等臂四倍體的嵌合體，所以導致其拷貝數為3.5。目前，診斷PKS的方法主要為細胞遺傳學及分子遺傳學兩類，本病例采用的細胞遺傳學技術為染色體核型分析，其是染色體檢查的“金標準”；但由于PKS特殊的細胞遺傳學特點，在不同組織中的檢出率有很大差別，所以染色體核型分析技術對PKS的檢出率并不高。本病例采用的分子遺傳學技術為CNV-seq，其不針對特定區域設計探針，而是進行全基因組測序，覆蓋了23對染色體，精確度高，可檢測到相對分子質量為100×103以上的染色體變異，并具有很好的重復性與擬合度，與芯片技術比較，具有成本低、通量高、覆蓋范圍廣及穩定性更高等優點。

PKS屬于染色體微缺失綜合征的一種。染色體的微缺失或微重復都屬于染色體的拷貝數變異,可引起微缺失或微重復綜合征，導致患兒身體出現不同程度器官功能異常、生長發育遲緩或智力損傷等[10]。有研究顯示，有1.65%的孕婦在產前診斷中可檢出有臨床意義的染色體微缺失或微重復[11]。要想有效預防出生缺陷，就需要進行大規模的產前篩查，并對高風險人群進行產前診斷。NIPT作為高通量測序在臨床應用最成熟的領域，其檢測胎兒染色體非整倍體異常已經成為臨床產前篩查的重要部分。2015年國際產前診斷協會針對NIPT出臺了最新臨床應用指南，明確指出NIPT可對染色體微缺失或微重復進行檢測[12]。近年來，隨著測序技術的進一步發展，一些實驗室引入了染色體微缺失或微重復的無創產前篩查，作為除了整個染色體非整倍體檢測之外的另一種選擇，稱之為擴展性的無創產前篩查技術[13]。擴展病種的無創性產前檢測，篩查的范圍擴大到全染色體基因組7 Mb的片段變異和常見的微缺失或微重復[14]，但目前并沒有充足的臨床應用反饋數據。本研究中采用NIPT篩查出胎兒12號染色體短臂重復片段大小為34.3 Mb,并通過CNV-seq證實與胎兒有創產前診斷結果相符，證明了NIPT對檢測染色體大片段的重復有較高的靈敏度和特異度。

綜上所述，PKS是一種散發的罕見染色體疾病，具有復雜的臨床表現及特殊的遺傳學特征，臨床上往往容易漏診,所以準確有效的產前診斷是避免缺陷患兒出生，減輕患兒家庭和社會負擔的最佳手段。臨床上，在產前發現羊水過多、先天性膈疝、過度發育的胎兒時應該高度警惕，同時建議孕婦完善產前診斷。此外，隨著NIPT技術的飛速發展，相信其在產前檢測領域將會做出更大的貢獻。