MLPA技術在DMD基因外顯子拷貝數變異家庭基因診斷及產前診斷中的應用

曾玉坤，劉 玲，羅曉輝，丁紅珂，余麗華，張 彥

(廣東省婦幼保健院醫學遺傳中心,廣東廣州 511400)

杜氏肌營養不良癥是一種由DMD基因缺失、重復或點突變導致的致死性X連鎖隱性遺傳神經肌肉疾病,DMD基因位于X染色體短臂Xp21處，是目前發現的人類最大的基因，發病率為1/3 500[1-3]。杜氏肌營養不良癥一般以男性多發，女性大多為致病基因攜帶者，主要臨床表現為進行性、對稱性肌無力，Gower征陽性，腓腸肌假性肥大。大多數患者在3～5歲發病，病情進展迅速，6歲以后出現行走困難，約10歲時多數患者就需使用輪椅生活，20～30歲時患者可因呼吸衰竭而死亡[3-5]，該病至今尚無治愈方法。目前，針對有杜氏肌營養不良癥家族史的家庭進行產前診斷是避免生育杜氏肌營養不良癥患兒的重要方法。多重連接依賴探針擴增(MLPA)技術是一種在單一反應管內同時檢測多達幾十個不同核苷酸序列拷貝數變異的檢測方法[6]。本研究采用MLPA技術對存在杜氏肌營養不良癥生育史的家庭進行基因診斷和產前診斷，進一步探討了MLPA技術的應用價值，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年1月就診于本院產前診斷門診，臨床表現為運動功能減退和進行性肌無力，血清肌酸激酶(CK)水平顯著升高，基因檢測結果明確為DMD基因缺失或重復突變的杜氏肌營養不良癥患兒(先證者)為研究對象，納入標準：明確診斷為杜氏肌營養不良癥的患兒，且其母親再次妊娠，并要求進行產前診斷。最終納入14個家系包括先證者、先證者母親及胎兒共42例作為研究組。同時選取血清CK及肌電圖正常，臨床診斷排除杜氏肌營養不良癥的3例健康成年男性作為對照組(依據杜氏肌營養不良癥為X連鎖隱性遺傳的特點，排除該病的健康成年男性可排除患者及攜帶者的可能性，適于作為檢測時的內對照使用)。研究組一般資料見表1。

表1 研究組一般資料

1.2方法

1.2.1DNA提取 抽取所有先證者及其母親外周靜脈血各2 mL，以乙二胺四乙酸二鉀抗凝。采用血液基因組DNA提取試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)提取外周血標本基因組DNA，操作方法嚴格按照說明書進行。所有先證者母親再次妊娠時在妊娠中期抽取羊水或絨毛標本進行產前診斷，羊水和絨毛標本均采用Qiagen DNA MINI Kit 50試劑盒進行DNA提取，操作方法嚴格按照說明書進行。對照組采集外周靜脈血2 mL，與研究組同批次、使用同種方法提取DNA，于-20 ℃中保存備用。上述提取的所有研究對象的全基因組DNA使用NanoDrop 2000分光光度計(美國Thermo公司)測得外周血DNA水平均大于100 ng/μL，羊水DNA和絨毛DNA水平均大于30 ng/μL，A260/A280為1.8～2.0。

1.2.2羊水和絨毛標本污染鑒別 提取的羊水DNA和絨毛DNA均采用熒光PCR毛細管電泳法檢測母親和胎兒第13、18、21號染色體上的13個微衛星多態標記位點，用以對羊水和絨毛標本進行污染鑒別，防止漏診或因母源污染而引起的誤診。

1.2.3MLPA檢測及結果分析 使用SALSA MLPA P034-B2和P035-B1 DMD試劑盒(荷蘭MRC Holland公司)對研究對象進行拷貝數變異檢測。操作流程及后續數據分析方法按照試劑盒說明書進行，主要操作步驟，(1)變性：依據提取的標本基因組DNA水平使用相應的試劑盒洗脫液將基因組DNA稀釋至5 μL(DNA總量為100～200 ng)，95 ℃變性5 min。(2)雜交：將變性后的基因組DNA冷卻至25 ℃，分別加入1.5 μL P034-B2和P035-B1探針，再加入1.5 μL MLPA Buffer，60 ℃雜交過夜(約16 h)。(3)連接：將溫度降至54 ℃，加入32 μL連接混合物(3 μL Buffer A、3 μL Buffer B、25 μL H2O、1 μL Ligase-65)，54 ℃連接15 min，然后98 ℃ 5 min終止連接反應。(4)PCR擴增：溫度降至25 ℃，加入10 μL PCR混合物(7.5 μL H2O、2 μL PCR Primer mix、0.5 μL SALSA Polymerase)；PCR擴增條件為：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個擴增循環；循環完成后于72 ℃再延伸20 min。(5)毛細管電泳分離及數據分析：PCR擴增產物通過ABI 3500毛細管電泳儀進行電泳分離，觀察各擴增產物電泳后的峰形圖，以對照組的檢測結果作為內對照，對檢測的原始結果使用Coffalyser Net軟件(荷蘭MRC-Holland公司)進行分析。

2 結 果

本研究利用MLPA技術對14例先證者、先證者母親和胎兒進行了DMD基因所有外顯子拷貝數變異檢測，其中先證者拷貝數缺失突變13例，重復突變1例，10例先證者發生45～54號區域內外顯子半合子缺失；家系1～8先證者拷貝數缺失或重復片段遺傳自其母親；胎兒拷貝數雜合缺失突變3例，雜合重復突變1例，其余10例胎兒未檢測到外顯子缺失或重復，未重復先證者基因型。見表2。

表2 14個家系DMD基因MLPA檢測結果

3 討 論

杜氏肌營養不良癥病死率高、預后不良，且至今尚無有效治療方法，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。為了避免杜氏肌營養不良癥患兒的出生，針對有該病患兒生育史的家庭，在明確先證者致病基因及類型的前提下進行產前診斷是預防該病發生的有效手段[7]。

DMD基因位于染色體Xp21區，全長約2.4 Mb，有79個外顯子，編碼了3 685個氨基酸，組成相對分子質量約為427×103的細胞骨架蛋白-抗肌萎縮蛋白[8]。DMD基因突變類型多樣，已報道的就有7 000余種[9]，其中主要以片段缺失最為常見，約占65%；其次為片段重復，約占10%；其他類型的致病突變包括點突變、微缺失等[10-11]。相關研究表明，雖然遺傳所致的DMD突變約占2/3，但新發突變占比高達1/3[12]，所以無杜氏肌營養不良癥生育史或家族史的家庭仍需要重視該病的可能發病風險。

本研究14個家系中先證者DMD基因拷貝數缺失突變13例，重復突變1例，且所檢測的拷貝數缺失、重復突變基本覆蓋該基因所有外顯子，其中第45～54號區域內外顯子發生缺失的頻率相對較高，本研究的14例先證者中有10例的拷貝數缺失突變與此區域內的外顯子有關，這與國內相關文獻報道的熱點缺失區域相符[3,5]。8個家系中先證者的DMD基因缺失或重復片段遺傳自其母親，另有6個家系先證者均明確存在DMD基因缺失突變，但其母親并未攜帶相同的致病突變，這些患兒可能是由其母親卵子形成時DMD基因發生新發突變或其母親存在生殖細胞嵌合所致。按照《中國假肥大型肌營養不良癥診治指南》的建議，生育過杜氏肌營養不良癥患兒的母親再次妊娠時應進行產前基因診斷[1]。

MLPA技術通過探針和靶序列DNA進行雜交、連接、PCR擴增、毛細管電泳分離及數據收集，再到后續的結果分析、得出結論，整個操作僅需1次反應就可以檢測幾十個靶序列拷貝數的改變，因而相較于傳統針對79個外顯子區域進行逐個序列檢測的分析方法有了極大簡化，檢測效率得到了明顯提高。此外，由于特殊的檢測原理，MLPA技術檢測靈敏度與特異度也非常高，相關數據表明其檢測準確度高達99%[13]。MLPA檢測試劑盒的商業化生產也讓其檢測操作變得更加簡便、穩定、重復性好。

MLPA技術雖然具備較多優點，但仍存在不能檢測未知的點突變及平衡易位等局限性,如果探針結合序列內存在點突變或微缺失等情況會導致外顯子缺失，檢測出現假陽性結果[14],因而對于臨床癥狀明顯，MLPA檢測陰性的受檢者，后續仍需要進行DNA測序以排除包括點突變、微缺失、微重復等其他突變類型。此外，鑒于MLPA技術會由于DNA變性不完全、鹽污染等因素而導致探針檢測信號的降低，使檢測結果所顯示的拷貝數比值處于臨界值區間內，此種情況也需要進行重復檢測驗證，以保證結果的準確性[15]。

綜上所述，運用MLPA技術能快速、準確且相對簡便地檢測DMD基因所有外顯子拷貝數變異，這為有杜氏肌營養不良癥患兒生育史的家庭明確致病因素提供了有效手段，同時為這類具有再生育意愿的家庭避免再次生育杜氏肌營養不良癥患兒提供了科學的指導依據。