子宮內膜異位癥患者血漿miR-125a-3p、miR-140-5p的水平變化及臨床意義

曹作增，王梅，沈曉萍

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院婦產科，上海 202150)

子宮內膜異位癥是指有活性的內膜組織(腺體和間質)種植在子宮內膜以外的位置而導致的一種女性常見婦科疾病[1-2]。目前，該病的發病機制有多種學說，其中被普遍認可的是子宮內膜種植學說[3-4]，但其具體機制仍在不斷研究中。微小RNA(miRNA)是一類序列具有高度保守性的非編碼單鏈RNA，其長度一般為18～30個核苷酸，主要通過作用于靶基因3′端非編碼區來抑制mRNA的翻譯或導致mRNA降解，通過調節細胞增殖、分化、凋亡、遷移、信號轉導等重要的生物學活動來參與多種疾病的病理、生理過程[5-6]。已有研究發現，多種miRNA與子宮內膜異位癥的發生、發展密切相關[7-9]。但微小RNA-125a-3p(miR-125a-3p)與微小RNA-140-5p(miR-140-5p)是否與子宮內膜異位癥相關目前尚不明確。本研究通過檢測子宮內膜異位癥患者血漿miR-125a-3p 與miR-140-5p的表達水平，探討其與子宮內膜異位癥的關系，以期為臨床診斷、治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年11月至2018年11月本院婦科門診收治的60例子宮內膜異位癥患者為研究組，年齡21～45歲,平均(34.61±6.92)歲；體質量52～65 kg,平均(58.43±6.49)kg。另選取同期體檢健康女性50例為對照組，年齡22～46歲,平均(35.29±7.06)歲；體質量51～63 kg,平均(57.23±6.35)kg。納入標準：(1)研究組患者均經臨床病理、影像學檢查確診為子宮內膜異位癥；(2)月經周期正常者；(3)患者及家屬同意加入本研究，并簽署知情同意書。排除標準：(1)近期服用過激素類藥物者；(2)伴有嚴重器質性疾病者；(3)合并其他婦科疾病者。兩組年齡、體質量等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 miRNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；miRNA反轉錄試劑盒、miRNA實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自哈爾濱海基生物科技有限公司；miR-125a-3p、miR-140-5p、U6(內參)引物購自上海生工生物工程有限公司；糖類抗原125(CA125)、血管內皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；DNA擴增儀(型號：Bio-Rad S1000)購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司，qRT-PCR儀(型號：ABI 7500)購自北京欣興強森生物科技有限公司；全自動生化分析儀(型號：PUZS-300)購自北京佳康時代醫療器械有限公司；酶標儀(型號：CN61M/GF-M2000)購自上海迪奧生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 所有研究對象均于清晨空腹采集靜脈血5 mL，置于含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)或檸檬酸鈉抗凝劑的聚乙烯試管中，在常溫3 000 r/min離心15 min，吸取上層血漿并分裝于無菌EP管中，于-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.2miR-125a-3p、miR-140-5p水平檢測 按照miRNA試劑盒說明書提取miRNA，反轉錄及qRT-PCR操作步驟具體如下。反轉錄體系共20 μL：miRNA(100 ng/μL)6 μL，4×One step miRNA RT Solution 5 μL,10×miRNA RT Primer 2 μL，RNase Free H2O 7 μL。反應條件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。以cDNA為模板，采用qRT-PCR儀對miRNA進行擴增。qRT-PCR反應體系共20 μL：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL，正向引物(10 μmol/L)0.5 μL，反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 13 μL。反應條件分為兩步：第一步95 ℃ 15 min；第二步95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，30個循環。采用2-ΔΔCt對miR-125a-3p、miR-140-5p相對表達水平進行定量分析。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3CA125、VEGF、TNF-α、IL-1β水平檢測 采用ELISA檢測CA125、VEGF、TNF-α、IL-1β水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1兩組各指標水平比較 研究組miR-125a-3p、miR-140-5p、VEGF、CA125、TNF-α、IL-1β水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組各指標水平比較

2.2研究組miR-125a-3p、miR-140-5p與CA125、VEGF、TNF-α、IL-1β的相關性 Pearson相關分析結果顯示，miR-125a-3p水平與miR-140-5p水平呈正相關(P<0.05)。miR-125a-3p、miR-140-5p水平與VEGF、CA125、TNF-α、IL-1β水平均呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 研究組miR-125a-3p、miR-140-5p與CA125、VEGF、TNF-α、IL-1β的相關性(r)

注：—為無數據；*P<0.05。

2.3各指標對子宮內膜異位癥的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，CA125診斷子宮內膜異位癥的曲線下面積(AUC)最大，為0.898，靈敏度為80.0%，特異度為94.0%。其次為miR-125a-3p，其AUC為0.862，靈敏度為86.7%，特異度為78.0%。miR-140-5p的AUC為0.759，靈敏度為71.7%，特異度為72.0%。見圖2、表4。

圖2 各指標診斷子宮內膜異位癥的ROC曲線

表4 各指標對子宮內膜異位癥的診斷價值

3 討 論

子宮內膜異位癥發病原因至今尚不明確，目前被廣泛接受的理論學說是異位種植學說。該學說認為子宮內膜異位癥是由于子宮內膜碎片隨經血逆流，通過輸卵管進入盆腔而種植于卵巢或盆腔其他部位所導致的[3-4,10]。腹腔鏡下病灶直視及病理檢查是目前臨床診斷子宮內膜異位癥的“金標準”，但其均為有創性檢查，對患者造成的創傷較大[8]。CA125屬于糖蛋白,來源于胚胎體腔上皮，多見于子宮內膜異位癥患者血清中，具有較高的靈敏度，為臨床診斷常用指標[11-12]。VEGF作為一種糖基化細胞分裂素，表達于子宮內膜細胞，在子宮內膜異位癥發生、發展過程中發揮著重要作用。TNF-α是由巨噬細胞產生的關鍵炎癥因子，可參與炎性反應、細胞分化及免疫調節等。IL-1β同樣在炎癥進展、免疫調節等方面發揮重要作用，與疾病引起的急性炎性反應存在密切聯系。上述指標均對子宮內膜異位癥具有一定的輔助診斷作用，但診斷的特異度低，效果不理想[13]。因此，近年來關于尋找子宮內膜異位癥特異性診斷標志物的研究成為熱點。

miRNA是近年來發現的具有調控基因表達功能的RNA，可穩定存在于血清、血漿、尿液等體液中[5-6]。目前已知有2 000余種miRNA參與調節機體各種疾病的病理、生理過程。miRNA在子宮內膜異位癥患者血清中存在差異性表達，可調控子宮內膜異位癥細胞外間質形成、血管形成、組織修復、炎癥發生等過程[8,14]。紀娜等[15]證實miR-155在異位內膜中高度表達，可能通過調控Bax、Bcl-2、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表達水平增強子宮內膜細胞增生、黏附、侵襲的能力。DAI等[16]發現miR-199a在異位內膜中表達水平下調，可作用于HIF-1α/VEGF-A通路，從而提高子宮內膜間質細胞的血管生成潛能。此外，miR-125b-5p、miR-154b-5p、miR-451a、miR-122等多種miRNA均參與子宮內膜異位癥的發生、發展[7]。miR-125a-3p、miR-140-5p在腫瘤中也發揮著重要作用。萬曉龍等[17]研究發現，miR-125a-3p不僅能夠阻礙結腸癌細胞的增殖生長,而且還可以抑制結腸癌細胞的遷移與侵襲,其在結腸癌進展中發揮重要調控作用。丁建花等[18]研究發現，miR-140-5p在肝細胞癌組織中低表達，并且與肝細胞癌的惡性程度密切相關。但miR-125a-3p、miR-140-5p是否參與子宮內膜異位癥的發生、發展，以及機制如何，目前尚不清楚。本研究結果顯示，子宮內膜異位癥患者血漿中miR-125a-3p與miR-140-5p水平均高于對照組(P<0.05)，提示miR-125a-3p與miR-140-5p與子宮內膜異位癥的發生、發展有關。

進一步研究發現，子宮內膜異位癥患者VEGF、CA125、TNF-α、IL-1β水平均高于對照組(P<0.05)，miR-125a-3p、miR-140-5p水平與VEGF、CA125、TNF-α、IL-1β水平均呈正相關(P<0.05)，提示miR-125a-3p與miR-140-5p可能通過調控VEGF、CA125、TNF-α、IL-1β的水平變化來參與子宮內膜異位癥的發病過程。ROC曲線分析結果顯示，CA125診斷子宮內膜異位癥的價值最高，其次為miR-125a-3p、miR-140-5p，提示miR-125a-3p、miR-140-5p對子宮內膜異位癥具有一定的診斷價值，可作為臨床輔助診斷指標。

4 結 論

綜上所述，子宮內膜異位癥患者血漿miR-125a-3p、miR-140-5p高表達，對子宮內膜異位癥具有一定的診斷價值。后期將繼續對miR-125a-3p、miR-140-5p在子宮內膜異位癥中發揮作用的具體機制進行研究，進一步探討其在疾病診斷、治療、預后評估中的應用價值。