血清ctDNA、CA72-4及CEA水平與胃癌患者化療療效的關系研究*

劉 靜,鄂緯建,常 璠,紀榮祖

(1.青海省西寧市第三人民醫院檢驗科，青海西寧 810005；2.青海大學醫學院附屬醫院檢驗科，青海西寧 810001)

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，發病率和病死率均占我國惡性腫瘤的第2位[1]。2015年相關數據顯示，我國每年胃癌新發病例數為67.9萬，死亡病例數為49.8萬，分別占全球的42.6%和45.0%[2]。但我國胃癌早期診治率低于10%，約90%的胃癌患者確診時已處于進展期，錯過了手術治療的最佳時機，此時手術后5年生存率低于30%[3-4]?；熗ǔＷ鳛檫M展期胃癌的主要治療手段，但目前缺乏預測化療預后的敏感生物標志物[5]。雖然有研究表明，糖鏈抗原72-4(CA72-4)和癌胚抗原(CEA)是診斷胃癌靈敏度較高的生物標志物，但關于其對胃癌化療療效評價方面的研究較少[5-8]。近年來，有文獻報道將循環腫瘤細胞DNA(ctDNA)應用于腫瘤放化療療效評價，ctDNA被稱為“液態活檢”，具有創傷小、可重復等優點[9-10]。本研究探討了血清ctDNA、CA72-4和CEA水平與胃癌患者化療療效的關系及其在化療療效判斷中的應用價值，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年10月至2013年2月在西寧市第三人民醫院接受根治性遠端胃大部切除術，并進行術后化療的早期胃癌患者30例作為研究對象。所有患者均經胃鏡檢查及病理活檢確診為早期胃癌，其中男19例，女11例；年齡35～78歲，平均(53±8)歲；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期9例；腫瘤直徑>5 cm者10例，≤5 cm者20例；分化型7例，未分化型23例。納入標準：卡氏評分>60分；第1次接受化療；能耐受全身靜脈化療且均能接受2個療程以上治療。排除標準：合并嚴重心、肝、腎等臟器疾??；既往接受過化療；對化療藥物過敏；合并腫瘤轉移；治療依從性差。本研究經西寧市第三人民醫院倫理委員會批準，獲得患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2化療方案 所有患者術后第4周給予DCF改良方案化療。第1天靜脈滴注多西他賽(江蘇恒瑞醫藥，批號:171109AF)75 mg/m2；第2天靜脈滴注奧沙利鉑(南京制藥廠有限公司，批號:201711112)130 mg/m2；第1～14天口服替吉奧膠囊(山東新時代藥業有限公司，批號:023170308)80 mg/(m2·d)，分早晚服用，然后停藥7 d再進行第2個療程。21 d為1個療程，連續治療2個療程。

1.3血清ctDNA、CA72-4和CEA檢測 分別于術后化療前和化療療程結束時收集患者清晨空腹靜脈血5 mL，3 500 r/min離心10 min，分離得到血清，-20 ℃保存待測。

1.3.1采用RT-PCR檢測血清ctDNA水平 量取血清750 μL，加入750 μL磷酸鹽緩沖液，混勻，95 ℃孵育10 min，16 000×g 離心10 min，取上清液，-80 ℃保存，備用。將PCR反應液(Super green 1.0 μL，PCR正向引物0.5 μL，PCR反向引物0.5 μL，Master 10.0 μL，H2O 6.0 μL，DNA模板2.0 μL)加入PCR擴增板內，蓋上透明膜，輕輕混勻，設置標準品孔和待測品孔。擴增條件：95 ℃ 5 min 1次，95 ℃ 10 s 45次，60 ℃ 20 s 45次，72 ℃ 20 s 45次。擴增結束后，檢測 Ct值，以標準品的Ct值做標準曲線，代入待測品Ct值計算得到ctDNA水平。

1.3.2血清CA72-4、CEA水平檢測 CA72-4和CEA ELISA試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司，檢測過程嚴格按照說明書進行。設置標準品孔、待測品孔和空白孔，除空白孔外，標準品孔加不同水平的標準品50 μL，待測品孔加待測標本50 μL；標準品孔和待測品孔中分別加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，封板膜封板后37 ℃孵育60 min；棄去液體，吸水紙吸干后用350 μL洗滌液洗滌5次，吸水紙吸干；每孔加底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加終止液50 μL，于450 nm波長下檢測各孔吸光度值。以標準品吸光度值和水平做標準曲線，代入待測品吸光度值，即可計算出待測品中CA72-4、CEA水平。陽性結果判斷標準：ctDNA>87.12 μg/L為陽性，≤87.12 μg/L為陰性；CA72-4>4.25 μg/L為陽性，≤4.25 μg/L為陰性；CEA>2.41 μg/L為陽性,≤2.41 μg/L為陰性。

1.4療效評價標準

1.4.1腫瘤標志物療效評價標準 依據腫瘤標志物療效評價標準[11]，完全緩解(CR)：升高的腫瘤標志物水平恢復正常且維持4周以上；部分緩解(PR)：升高的腫瘤標志物水平下降≥65%，并維持4周以上；疾病穩定(SD)：升高的腫瘤標志物水平下降<65%或腫瘤標志物水平升高<40%；疾病進展(PD)：腫瘤標志物水平升高≥40%或從正常水平到超過正常水平，或升高的腫瘤標志物水平未降至正常值10倍以下。

1.4.2客觀療效評價標準 按照RECIST 1.1標準[12]評估患者療效。CR：所有病灶均消失不見；PR：基線病灶最大徑之和減少30%以上；SD：基線病灶最大徑之和有減少但未達PR，或有增加但未達PD；PD：基線病灶最大徑之和至少增加20%或出現新病灶。經化療后客觀療效評價，本研究納入的30例患者中，CR患者10例，PR患者9例，SD患者6例，PD患者5例。

1.4.3有效、無效判斷 以上兩種評價標準均根據療效將CR、PR界定為有效，將PD、SD界定為無效。

1.4.4預后評價 化療結束后對所有患者進行為期5年的隨訪，以5年生存人數和總生存率作為最終遠期預后評價指標。

2 結 果

2.1不同客觀療效患者化療前后ctDNA、CA72-4、CEA水平比較 化療后CR和PR患者ctDNA、CA72-4和CEA水平與化療前比較均明顯降低(P<0.05)；SD和PD患者中，ctDNA水平化療前后差異無統計學意義(P>0.05)，而CA72-4和CEA水平化療后與化療前比較均明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 不同客觀療效患者化療前后ctDNA、CA72-4、CEA水平比較

2.2腫瘤標志物療效與客觀療效評價一致性結果 ctDNA、CA72-4、CEA聯合檢測的療效評價符合率為93.33%，明顯高于各指標單獨檢測的符合率(P<0.05)；且3項指標聯合檢測的Kappa值為0.71，吻合度較強，一致性較好；ctDNA、CA72-4、CEA單獨檢測的Kappa值分別為0.37、0.31、0.12，吻合度均較弱，見表2。

表2 腫瘤標志物療效與客觀療效評價一致性結果

續表2 腫瘤標志物療效與客觀療效評價一致性結果

注：與ctDNA+CA72-4+CEA比較，*P<0.05。

2.3ctDNA、CA72-4、CEA對胃癌化療療效的評估價值及與化療預后的關系 ROC曲線分析結果顯示，以客觀療效評價結果為標準，ctDNA、CA72-4、CEA聯合檢測評估胃癌化療療效的靈敏度為94.74%，特異度為90.91%，曲線下面積(AUC)為0.915，均高于3項指標單獨檢測，見表3。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA陰性患者總生存率均明顯高于陽性患者(χ2=5.625，P=0.018；χ2=4.073，P=0.044；χ2=4.344，P=0.037)，見圖1。

注：A為CEA的Kaplan-Meier生存曲線；B為CA72-4的Kaplan-Meier生存曲線；C為ctDNA的Kaplan-Meier生存曲線。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線

表3 ctDNA、CA72-4、CEA單獨及聯合檢測對胃癌化療療效的評估價值

注：—為無數據。

2.4胃癌患者化療預后的影響因素分析 單因素分析結果顯示，腫瘤直徑、分化程度、ctDNA、CA72-4和CEA對患者化療預后有影響(P<0.05)，見表4。將對化療預后有影響的因素納入多因素Cox回歸分析，結果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA是影響胃癌患者化療預后的獨立因素(P<0.05)，見表5。

表4 影響胃癌患者化療預后的單因素分析

續表4 影響胃癌患者化療預后的單因素分析

表5 影響胃癌患者化療預后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

腫瘤標志物是可以反映腫瘤生長轉移的一類物質。研究顯示，腫瘤標志物與腫瘤增殖和腫瘤細胞數量直接相關[7]，提示通過檢測腫瘤標志物表達水平可以評估腫瘤治療效果和預后。理想的腫瘤標志物應具有高特異度、高靈敏度、便于檢測等特點，然而單一腫瘤標志物特異度、靈敏度低，現在多建議采用多個標志物聯合及動態檢測[13]。

CEA是一種腫瘤細胞表面抗原，所有內胚層來源腫瘤均可見CEA表達異常，其主要用于消化道腫瘤檢測。CA72-4是一種高分子糖蛋白類癌胚抗原，是檢測胃癌的首選腫瘤標志物。有研究發現，胃癌患者化療后CEA、CA72-4水平較化療前明顯降低，同時還發現胃癌患者CEA水平與分化程度呈負相關[14-16]。本研究結果顯示，胃癌化療后客觀療效為CR和PR的患者CEA和CA72-4水平較化療前明顯降低且恢復至正常水平范圍內，而客觀療效為SD和PD患者的血清CEA和CA72-4水平較化療前明顯升高，提示CEA、CA72-4可以作為胃癌療效評價的重要參考指標。本研究進一步分析了CEA和CA72-4評價化療療效的價值，將其與客觀療效評價結果進行比較，發現CEA和CA72-4評價結果與客觀療效評價結果的符合率分別為56.67%和66.67%，Kappa值分別為0.12和0.31，提示CEA和CA72-4單獨應用評價胃癌化療療效價值較低，分析其原因可能與以下因素相關：CEA或CA72-4可以與血液中其他抗原相互結合，導致部分胃癌患者接受化療后會出現短暫、可恢復的CEA水平升高[17]，從而影響結果判斷，導致與客觀療效的評價符合率較低，提示CEA和CA72-4水平的升高并不一定存在腫瘤進展或復發轉移，可能是這部分患者對化療的短暫反應?；诖?，SORBYE等[18]也建議不應單獨依據CEA或CA72-4水平來評價胃癌患者化療療效。

循環腫瘤細胞和ctDNA被認為是惡性腫瘤發生轉移的重要標志物，對預后判斷具有一定的指導意義[19]。有文獻報道，ctDNA可以作為監測胃癌進展的生物標志物，是整體生存率及無進展生存率的預測因素之一[20]； 還有文獻報道，ctDNA可以用于多種腫瘤包括乳腺癌、結直腸癌、胃癌等的預后和療效評估[21-22]。本研究發現，胃癌化療后客觀療效為CR和PR的患者ctDNA水平較化療前明顯降低且恢復至正常水平范圍內，客觀療效為SD和PD的患者ctDNA水平較化療前比較無明顯變化，提示ctDNA水平可以作為胃癌化療療效評價的指標。進一步對ctDNA評價胃癌化療療效與客觀療效結果的一致性進行了分析，結果發現，二者療效評價符合率為73.33%，吻合度較弱(Kappa值為0.37)，分析其原因：腫瘤細胞被機體自然殺傷細胞吞噬而導致血液中殘留的ctDNA水平較低；但ctDNA檢測結果易受到采血時間、飲食、個體差異等因素影響，導致檢測水平波動較大，從而影響對化療療效的評價[23-24]。

本研究將ctDNA、CA72-4和CEA 3項指標進行聯合檢測，結果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA聯合檢測評價的胃癌化療療效結果與客觀療效結果的符合率為93.33%，吻合度較強(Kappa值為0.71)，提示3項指標聯合檢測在胃癌療效評價中具有重要價值。

為了進一步評價ctDNA、CA72-4和CEA水平對胃癌化療療效的評估價值，本研究進行了ROC曲線分析，結果顯示，ctDNA、CA72-4、CEA聯合檢測對胃癌化療療效評估的靈敏度、特異度和AUC均高于3項指標單獨檢測，提示3項指標聯合檢測可以有效評估胃癌化療療效，指導臨床治療。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA陰性患者總生存率均明顯高于陽性患者，提示上述3項指標可以作為評價胃癌遠期預后的重要參考指標。多因素Cox回歸分析結果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA是影響胃癌化療患者預后的獨立因素。此外，由于本研究納入的病例為早期胃癌患者，并未發現年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期和分化程度對胃癌化療療效的獨立影響。

4 結 論

綜上所述，血清ctDNA、CA72-4和CEA聯合檢測對于早期胃癌化療的遠期療效預測具有較高準確性，其療效評價與客觀療效評價結果一致性較好。但是由于本研究納入的病例數較少，結果的可靠性和科學性還需要后續積累樣本量以進一步驗證。