新型冠狀病毒肺炎的實驗室分子診斷及生物安全

鄧少麗，劉 丁

(陸軍特色醫學中心：1.檢驗科;2.疾病預防控制科，重慶 400042)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是指由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染導致的病毒性呼吸道疾病。我國科學家從SARS-CoV-2感染者的支氣管、肺泡灌洗液標本中檢測出泛β-冠狀病毒核酸陽性，并利用Illumina二代測序和Nanopore三代測序技術獲得了病毒的全基因序列。隨后，國內各種核酸檢測試劑盒相繼面世，主要包括實時熒光定量PCR(RT-qPCR)、恒溫擴增技術及快速卡式熒光PCR技術等。目前，RT-qPCR成為SARS-CoV-2核酸檢測的主流方法。隨著分子診斷的廣泛開展，SARS-CoV-2實驗室分子診斷的靈敏度、特異度及實驗室生物安全等問題成為研究的焦點。進一步規范檢測技術，確保實驗室生物安全是做好疫情防控工作的前提和保障。筆者根據多年的實驗室工作經驗，結合抗擊非典型肺炎、埃博拉病毒及COVID-19等工作經歷，從以下幾方面進行系統闡述，以期為臨床實驗室病原體核酸檢測及生物安全提供參考。

1 病例定義

1.1疑似病例 疑似病例大多有流行病學史，如在發病前14 d內有武漢市及周邊地區或其他有病例報告社區的居住史或旅行史；發病前14 d內與SARS-CoV-2檢測陽性者有直接接觸史；發病前14 d內曾接觸過來自武漢市及周邊地區或其他有病例報告社區的發熱或呼吸道感染癥狀患者；聚集性發病。針對疑似病例，可對其進行流行病學史詢問，并結合臨床表現進行綜合分析。臨床表現主要包括：發熱或呼吸道感染癥狀；具有COVID-19的影像學特征；白細胞計數正常或降低，淋巴細胞計數降低。具有上述流行病學史中的任何1項，同時符合臨床表現中的2項者，則可定為疑似病例[1]。

1.2確診病例 具有實驗室分子診斷的病原學證據，確認為SARS-CoV-2核酸陽性的患者即可診斷為確診病例[2]。實驗室分子診斷主要包括：RT-qPCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性；病毒基因測序發現與已知的SARS-CoV-2高度同源；除鼻咽拭子外，采集其他體液、分泌物進行病毒核酸檢測結果陽性[1]。目前，RT-qPCR檢測病毒核酸是實驗室確認的首選方法。血清SARS-CoV-2特異性IgM抗體和IgG抗體陽性也可作為病原學證據，對病毒核酸檢測進行有效補充[3]。

1.3可能病例 除了確診病例和疑似病例的定義外，從實驗室診斷的角度，筆者建議需要設置可能病例。可能病例可定義為有明確流行病學史和臨床癥狀，但RT-qPCR檢測結果陰性。按照國際應對埃博拉病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒的慣例，設置可能病例可減少核酸檢測假陰性引起的漏診[4]。同時，建議對可能病例進行SARS-CoV-2核酸重復檢測。

此外，對于接觸過COVID-19確診病例，且未進行有效防護的人群，也應納入分子檢測中。主要包括以下情況：與確診病例共同生活；對COVID-19患者提供醫療診治、護理時存在相關暴露；與確診COVID-19的醫護人員一起工作；直接接觸過確診病例的呼吸道分泌物者等。

2 臨床實驗室檢測

鑒于現階段SARS-CoV-2感染仍在流行，為更好地開展核酸檢測工作，各醫療機構臨床實驗室應在確保生物安全和檢測質量的前提下開展RT-qPCR，用于臨床COVID-19診斷。RT-qPCR核酸檢測的適應證包括:(1)用于確診疑似病例;(2)篩查有流行病學史的人群;(3)鑒別診斷發熱、社區獲得性肺炎及急性呼吸窘迫綜合征患者等。同時建議實驗室也應該檢測其他呼吸道相關病原體，如流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒等，但不應該因為增加檢測項目而延誤對SARS-CoV-2的及時檢測。

2.1標本類型和標本采集 SARS-CoV-2檢測的標本類型包括呼吸道標本、血液標本、消化道標本[1]。呼吸道標本包含鼻咽拭子、口咽拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等，見表1。由于SARS-CoV-2造成的是下呼吸道感染，對患者而言，深咳痰液和支氣管、肺泡灌洗液等下呼吸道標本為核酸檢測首選[5]。但由于臨床取樣困難，目前核酸檢測常用標本為鼻咽拭子和口咽拭子，但重癥病例應優先采集下呼吸道標本，如深咳痰液和支氣管、肺泡灌洗液。上呼吸道標本的采集十分重要，合格的標本是檢出的關鍵。鼻咽拭子和口咽拭子標本應分別從鼻咽壁和口咽壁正確采集，以提高檢測陽性率，而不是簡單地從鼻孔或口腔采集。在標本收集中，可將鼻咽拭子和口咽拭子置于同一病毒保存液中。為保證病毒核酸的穩定性及檢測的靈敏度，建議選用帶塑料桿的合成纖維植絨拭子，不宜使用海藻酸鈣拭子或木桿拭子，因為其可能含有滅活病毒和抑制PCR反應的物質。對于無癥狀者，誘導排痰或強迫咳痰有助于收集下呼吸道標本。在診斷標準中，血液標本也可用于檢測SARS-CoV-2，但在臨床檢測中其陽性率低，不建議作為SARS-CoV-2篩查的常規檢測標本。

表1 SARS-CoV-2檢測的標本類型、容器與保存液及轉運條件

在對有癥狀的確診、疑似或可能病例進行常規標本采集時，采集人員應嚴格按照中國國家衛生健康委員會《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》的要求，個人防護裝備包括N95及以上的防護口罩、護目鏡、連體防護服、雙層乳膠手套、防水靴套[1]。如果接觸患者血液、體液、分泌物或排泄物時，應及時更換外層乳膠手套。此外，當氣管插管、支氣管或肺泡灌洗、咳痰等氣溶膠暴露時，應加戴正壓頭套或全面型呼吸防護器。采集人員除需熟練掌握個人防護用品的使用技能外，還需經當地疾病預防控制中心或所在醫療機構的相關標本采集培訓。門診和住院患者由所在醫院醫護人員負責采集；密切接觸者標本由當地疾病預防控制中心采集。采集過程最好在配有負壓通風系統或每小時6～12次換氣的常壓隔離單人間內進行。嚴格限制參與采集工作的醫護人員人數，避免不必要的接觸。采集人員在接觸患者前后，以及在脫卸個人防護用品的每一步驟前后，均應嚴格進行手衛生。采集結束后，做好環境清潔與消毒工作，層流房間空氣自凈30 min，普通房間用紫外線消毒。

2.2標本的包裝與運輸 對于醫療機構的內部運送，可采用雙層包裝系統。所有標本必須先用帶螺旋蓋的防漏塑料主容器包裝，并用75%乙醇擦拭消毒容器表面，再用可重復、密封、抗壓的二次容器包裝，消毒后安全運送至實驗室。隨行標本中應有準確的標簽或條形碼，包括至少2個標識的患者身份信息，以避免標本混亂和污染。對于機構外的運送，則必須按照生物安全的需要，使用三重包裝系統的生物安全運送箱；一重包裝與醫院內部運送相似，所有標本必須用雙層容器包裝；二重包裝容器中應裝有相關的信息表，如申請表格或三重包裝容器中的信息表格；每重包裝都需嚴格消毒，防止對外部環境及人員的污染。標本的容器與保存液、轉運條件見表1。

2.3標本處理和核酸提取 標本應盡快檢測，檢測前建議56 ℃ 45 min滅活。若在24 h內檢測，可置于4 ℃保存；若24 h內無法檢測，則置于-70 ℃或以下保存。SARS-CoV-2 RNA的提取應根據實驗室條件、試劑盒說明書要求，采用適當的人工或自動核酸提取方法，主要的核酸提取方法有磁珠法、離心柱法和一步裂解釋放法。從痰液、糞便、鼻咽拭子、口咽拭子或血液中提取核酸，應根據儀器或試劑盒制造商的說明書進行。RNA標本應儲存在-70 ℃或更低的溫度中。

2.4SARS-CoV-2的分子檢測及結果判讀 建議使用RT-qPCR對SARS-CoV-2的RNA進行分子檢測。推薦選用SARS-CoV-2的開放讀碼框1ab(ORF1ab)、核殼蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因作為檢測靶標，并提供陽性對照和內標。實驗室確認陽性病例需滿足以下2個條件中的1個[1]：(1)同一份標本中SARS-CoV-2 2個靶標(ORF1ab、N或E)RT-qPCR檢測結果均為陽性；如果出現單個靶標陽性的檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測；如果重新檢測結果仍然為單個靶標陽性，則可判定為陽性。(2)2種類型標本RT-qPCR檢測結果同時出現單個靶標陽性或同種類型標本2次采樣檢測中均出現單個靶標陽性的結果，可判定為陽性。

結果判讀的第一步是驗證內控。內控陰性表明擴增過程失敗，可能是由于存在PCR抑制劑或其他原因。在這種情況下，為了消除抑制作用，需要對處理后的同一標本進行重新檢測，包括重新提取或稀釋提取的核酸。在疑似病例中獲得不確定的結果時，應立即向醫院的感染控制部門報告。核酸檢測結果陰性不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括標本質量差，標本采集得過早或過晚，沒有正確的保存、運輸和處理標本，技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。若有明確接觸史的病例出現多次陰性結果，且不應排除SARS-CoV-2感染時，應通過采集其他部位的標本(特別是下呼吸道標本)來進一步檢測；也可將標本送至其他有資質的單位進行檢測確認[6]。以靶標ORF1ab、N為例，SARS-CoV-2核酸檢測結果判讀流程見圖1。

圖1 SARS-CoV-2核酸檢測結果判讀流程圖

3 實驗室生物安全

對于疑似、確診或可能病例的臨床標本，診斷工作和RT-qPCR檢測應在具有BSL-2設施的臨床實驗室進行。按照《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》要求，應穿戴適當的個人防護裝備，所有技術程序都應在現有認證的Ⅱ類生物安全柜中進行，盡量減少氣溶膠和液滴的形成[1]。完成檢測工作后，用75%的乙醇消毒工作空間，去除所有個人防護用品。在離開實驗室之前，無論何時摘除個人防護用品，手衛生都是必要的。根據醫療廢物的立法規定，所有的醫療廢物和剩余標本都應該被丟棄，但是對于經RT-qPCR檢測SARS-CoV-2呈陽性的臨床標本，應該在滅菌后丟棄。具有潛在傳染性的操作，其稀釋或分離等處理程序應在生物安全柜內進行[6]。此外，為了防止檢測過程中的污染，為實驗室工作人員提供一個安全的環境，應考慮包括實驗室布局、檢測流程和生物安全設施等問題。

綜上所述，COVID-19流行期間實驗室分子診斷對于疾病確診和密切接觸者的排查顯得尤為重要。各臨床實驗室應積極制訂應對措施以預防和控制COVID-19及其他新發傳染病引起的公共衛生事件，進一步提升實驗室分子診斷的能力建設與生物安全。