電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體尿液中鎘含量的研究

明劍輝 李致明 梁國榮 歐映紅

廣東省清遠市清新區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗科，廣東清遠 511800

隨著工業(yè)的飛速發(fā)展，空氣、水土等環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，重金屬中毒事件越來越多。傳統(tǒng)的金屬元素測定方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、二苯碳酰二肼比色法等，檢測時間長，常難以滿足臨床快速檢測的需求[1]。電感耦合等離子質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）是近年發(fā)展迅速的一種理化檢測技術(shù)，能同時測定多種金屬元素含量，分析速度快且靈敏度、精密度高，被廣泛用于生物、環(huán)境和地質(zhì)等領(lǐng)域[2-3]。鎘（Cd）元素是普遍存在于自然界礦石、土壤、大氣與海水中的一種稀有金屬元素，被鎘污染的空氣、水源與食物對人體危害極大，日本曾出現(xiàn)鎘中毒引起的痛病，患者最初表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，逐漸演變?yōu)樯窠?jīng)痛與全身骨痛，最后導(dǎo)致骨骼萎縮、四肢彎曲變形[4]。尿鎘是重要的生物監(jiān)測指示物，反映的是人體和環(huán)境中鎘負(fù)荷，本研究為評價清遠地區(qū)環(huán)境鎘負(fù)荷量，采用ICP-MS 法對清遠地區(qū)工人進行了尿液中鎘含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2018 年1 ～12 月在清遠市各大工廠進行體檢的健康工人200 例作為研究對象，所有受試者無嚴(yán)重心、肝、腎等器質(zhì)性疾病，無重大傳染性疾病，無過往嚴(yán)重病史，每位受試者提供尿液樣本至少＞50mL（將其置于-20℃冰箱保存）。200例受試者中男：女=93：107，年齡18 ～65 歲，平均（34.8±5.7）歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器與試劑 高分辨電感耦合等離子質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific 公司，型號：ICAP RQ）；密閉式智能微波消解儀（上海袁析儀器有限公司，型號：MWD-800）渦旋儀（北京科爾德實驗儀器廠，型號：WH-861）；濃硝酸（德國Merck 公司，體積分?jǐn)?shù)為65%）；鎘單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國計量科學(xué)研究院GBW08612，質(zhì)量濃度為1000μg/mL），采用1%稀硝酸配制成質(zhì)量濃度為20μg/L 的Cd 元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液；銦-115（鋼鐵研究總院，質(zhì)量濃度為1000μg/mL），采用1%稀硝酸配制成質(zhì)量濃度為10μg/L 的內(nèi)標(biāo)儲備液；質(zhì)量濃度為 1.0μg/L 質(zhì)譜調(diào)諧液標(biāo)準(zhǔn)溶液（美國Thermo Fisher 公司）；實驗用水為超純水（電阻率為18.25MΩ·cm）。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液配制 將Cd 標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液稀釋成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，將內(nèi)標(biāo)儲備液配逐級稀釋，制成100μg/L 的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.2.3 儀器參數(shù)設(shè)定 設(shè)定高分辨電感耦合等離子質(zhì)譜儀主要的參數(shù)：射頻功率為1600W；采樣深度8mm；等離子體氣流速15L/min；矩管水平位置為-0.5mm；輔助氣流速為0.25L/min；矩管垂直位置0mm；載氣流速0.85L/min；掃描模式為全掃描；積分時間為0.1s；采集次數(shù)為3 次；提取透鏡1 為2V；提取透鏡2 為-105V；氧化物干擾＜3%；雙電荷干擾＜1.5%。

1.2.4 尿樣前處理 將所有患者的尿液樣本置于室溫解凍，渦旋混勻后分為兩份，分別采用如下兩種方式進行前處理。直接稀釋法：用體積分?jǐn)?shù)為1%的硝酸將尿樣稀釋20 倍后測定；微波消解法：準(zhǔn)確量取2.5mL 尿樣置于微波消解罐，加入2mL 的硝酸與1mL 的雙氧水，設(shè)定微波消解程序，消解后用超純水頂溶質(zhì)至100mL。

1.2.5 樣本測定 直接稀釋處理樣本以1%的硝酸溶液作為空白對照，微波消解樣本以5%的硝酸溶液作為空白對照，分別將空白對照或標(biāo)準(zhǔn)工作液注入等離子質(zhì)譜儀中，使用蠕動泵在線加入內(nèi)標(biāo)溶液（按照內(nèi)標(biāo)：待測液=1：1），用Y 接頭與樣品混合，測定Cd 元素分析譜線強度信號響應(yīng)值，以Cd 元素與115In 響應(yīng)信號值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將前處理好的尿液樣本溶液與內(nèi)標(biāo)溶液同樣采用蠕動泵加入，測定待測尿樣樣本中Cd 元素分析譜線強度信號響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的得到每個尿中Cd 元素濃度，平行重復(fù)測定3 次取平均值，同時作空白對照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測得的線性相關(guān)程度是否符合《尿中釩、鉻、鈷、鎘、鉈、鉛的測定電感耦合等離子體質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)[1]，比較直接稀釋法與微波消解法兩種方法處理樣本的效果，即兩種方法測得人群Cd濃度的差異；觀察人群尿鎘水平是否在正常范圍（既往研究[4]指出正常尿鎘水平為0 ～25μg/L）；比較尿鎘在不同性別，不同年齡之間的負(fù)荷差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理分析，計量資料以（）表示，采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測結(jié)果

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=6566.8x ＋4928.1，相關(guān)系數(shù)為0.9975，線性良好，檢測范圍為0.1 ～20μg/L，符合《職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南 第5 部分：生物材料中化學(xué)物質(zhì)測定方法》的要求。見圖1。

圖1 鎘的標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.1 ～20ug/L）

2.2 兩種前處理方法比較

直接稀釋法測得200 例人群尿樣的平均響應(yīng)值為25951.58cps，Cd 平均含量為2.87μg/L，微波消解法測得平均響應(yīng)值為26334.53cps，Cd 平均含量為2.93μg/L，均在正常范圍內(nèi)，兩種方法測得結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 兩種前處理方法測定結(jié)構(gòu)的比較（，μg/L）

表1 兩種前處理方法測定結(jié)構(gòu)的比較（，μg/L）

組別 尿樣份數(shù) 尿鎘平均水平直接稀釋組 200 2.87±1.78微波消解組 200 2.93±1.82 t 0.333 P 0.739

2.3 不同性別、年齡段人群間的尿鎘水平比較

男女人群間Cd 元素含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；Cd 元素含量在＜20 歲，20 ～40歲，＞40 歲三組年齡段間呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；兩種前處理方法間不同性別、年齡人群的尿鎘水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 不同性別、年齡段人群間尿鎘水平的比較（，μg/L）

表2 不同性別、年齡段人群間尿鎘水平的比較（，μg/L）

注：與＜20 歲人群比較，aP ＜0.05；與20 ～40 歲人群比較，bP ＜0.05

項目 n 直接稀釋組 微波消解組 t P性別 男 93 2.95±1.86 3.01±1.92 0.216 0.829女 107 2.71±1.62 2.82±1.57 0.504 0.615 t 0.947 0.746 P 0.345 0.457年齡（歲） ＜20 41 1.85±0.79 1.87±0.76 0.117 0.907 20～40 96 2.88±1.36a 2.91±1.40a 0.151 0.880＞40 63 3.42±1.47ab 3.38±1.42ab 0.155 0.877 F 18.111 16.916 P ＜0.001 ＜0.001

3 討論

鎘是存在于自然界中的一種稀有金屬，正常環(huán)境狀態(tài)下含量很低，不會影響人體健康，當(dāng)環(huán)境受到鎘污染后，鎘通過食物、水和空氣進入人體富集引發(fā)慢性中毒[5]。鎘在正常成人中負(fù)荷量為30 ～45mg，經(jīng)尿液排出體外，檢測人體尿液中鎘元素含量，可從側(cè)面評價環(huán)境鎘元素暴露水平[6-7]。ICP-MS 是20 世紀(jì)80 年代發(fā)展起來無機元素與同位素分析測試技術(shù)，具有速度快、靈敏度高、精密度高及抗干擾等優(yōu)點，被廣泛運用于地質(zhì)、環(huán)境與生物檢測中[8]。本文采用ICP-MS 對清遠地區(qū)工廠體檢健康人群尿鎘水平進行測定，來評價清遠地區(qū)工廠鎘負(fù)荷水平。

ICP-MS 法主要原理是通過在電感線圈上施加強大功率的高頻射頻信號形成高溫等離子體，并由氣體推動保證等離子體平衡與持續(xù)電離，將待測樣霧化成氣溶膠后再經(jīng)蒸發(fā)、分解、激發(fā)和電離呈帶電粒子進行質(zhì)譜分析[9]。鎘的第一電離能高，屬于難電離元素，需要較高能量的電感耦合等離子體焰滿足測定的靈敏度與準(zhǔn)確度，本研究中采用1600kW 射頻功率來進行電離[10]。ICP-MS 法圖譜簡單，易于解析，但也存在光譜干擾和基體效應(yīng)，為減小基體干擾，通常選用尿液樣本不存在且與鎘元素的質(zhì)量數(shù)和電離電位相近的同位素[11]。常用的內(nèi)標(biāo)元素有Li、Sc、Ge、Y、Rh、In 等，本研究采用與Cd 相對分子質(zhì)量相近的115In 同位素作為內(nèi)標(biāo)[12]。結(jié)果顯示采用ICP-MS 法測定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=6566.8x+4928.1，相關(guān)系數(shù)為0.9975，線性良好，檢測范圍為0.1 ～20μg/L，符合《職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南第5 部分：生物材料中化學(xué)物質(zhì)測定方法》的要求。

ICP-MS 法測定前采用微波消解法與直接稀釋法測量結(jié)果差異不大，可能是因為尿液只含有少量沉渣（主要為細胞、管型、結(jié)晶和細菌等有形成分），其他固體物質(zhì)較少，微波消解可以發(fā)揮的作用不大，而直接稀釋法操作簡單、快速，更適合用于處理批量尿液樣本。正常人的尿鎘水平為0 ～25μg/L，直接稀釋法測得200 例工廠人尿樣中Cd 平均含量為2.87μg/L，微波消解法測得2.93μg/L，均在正常范圍內(nèi)，表明清遠地區(qū)工廠鎘暴露水平處于正常范圍，環(huán)境未受到鎘污染。既往研究表明，男性抽煙會加重鎘吸收入肺，導(dǎo)致男性的鎘負(fù)荷高于女性[13]，本研究中男性尿鎘水平雖稍高于女性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與樣本基數(shù)不夠大，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)一定程度偏倚有關(guān)。結(jié)果還顯示，隨著年齡增長，尿鎘水平有增加趨勢，這是因為人從出生開始就不斷從環(huán)境中攝取鎘，而鎘在人體內(nèi)代謝很慢，鎘不斷蓄積，所以鎘負(fù)荷總體水平會隨著年齡增長而增加[14-15]。

綜上所述，直接稀釋法相比微波消解法，處理簡單快速，更適用于大批量尿樣中元素含量的測定。ICP-MS 測得清遠地區(qū)工廠健康人群尿中鎘含量均處于正常范圍內(nèi)，且有隨著年齡增長而遞增的趨勢。