苦碟子總黃酮提取純化工藝研究

劉 芳 武 勇 周應(yīng)軍 譚衛(wèi)忠

1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院，山西長(zhǎng)治 046000；2.山東福牌阿膠股份有限公司，山東濟(jì)南 250100；3.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410083；4.國(guó)藥控股濟(jì)南有限公司，山東濟(jì)南 250116

苦碟子為菊科植物抱莖苦荬菜Ixeris sonchifolia（ Bge.） Hance 的干燥全草[1]，在中國(guó)、朝鮮、日本、俄羅斯等國(guó)均有分布，我國(guó)主要分布于東北及內(nèi)蒙古等地，收錄于《全國(guó)中草藥匯編》。苦碟子味苦、辛、性寒，能止痛、清熱、解毒、消腫，主治頭痛，牙痛，胃腸痛及外傷、中小手術(shù)后頭痛[2]。在民間常被用作野菜、飼料，近年來(lái)隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)主要含有黃酮類(lèi)、倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、三萜類(lèi)、核苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等化合物[2]，其中黃酮類(lèi)化合物含量較高，主要有木犀草素、芹菜素及其苷類(lèi)[3-7]。現(xiàn)代藥理研究表明，苦碟子黃酮類(lèi)成分能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基的清除能力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，解除冠脈痙攣，減少血小板聚集， 減輕心肌梗死，缺血心肌FFA 含量，從而對(duì)心肌缺血/再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[8-10]。苦碟子總黃酮通過(guò)拮抗細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減少自由基的產(chǎn)生，抑制NO 生成，產(chǎn)生對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[11-12]。因此縮短提取純化工藝，提高總黃酮的提取率，具有非常重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)采用適合于工業(yè)生產(chǎn)成本低、便于操作的水提醇沉法對(duì)苦碟子總黃酮的水提醇沉工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并采用聚酰胺樹(shù)脂純化總黃酮粗提物，通過(guò)不同條件下聚酰胺樹(shù)脂對(duì)苦碟子總黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附與解吸特性的研究，確定最佳純化工藝。本工藝具有操作簡(jiǎn)單、方便、安全，成本低、效率高的特點(diǎn)，為苦碟子總黃酮工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

TU-1810 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（ 北京普析通用有限公司），AUW220D 十萬(wàn)分之一電子分析天平（日本島津公司），KQ 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率250W，頻率40kHz），F(xiàn)D-A10N-50 型冷凍干燥機(jī)[冠森生物科技（上海）有限公司]。

苦碟子藥材采自黑龍江哈爾濱，由作者鑒定為菊科植物抱莖苦荬菜I.sonchifolia （ Bge.） Hance的干燥全草，蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111528-200606）。聚酰胺（60 ～80 目，青島海洋化工廠）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦碟子總黃酮的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取105℃的干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20.4mg，精密稱(chēng)定，置25mL 容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，濃度為0.8160mg/mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 精密吸取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ) 備 液1、2、3、4、5mL 分 別 置 于25mL 容 量 瓶 中，加60%乙醇至刻度，搖勻，濃度分別為0.03264、0.06528、0.09792、0.13056、0.1632mg/mL。分別取5mL 置于10mL 容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3mL，搖勻，放置6min。再加入10%硝酸鋁0.3mL，搖勻，放置6min 后，加入1mol/L 的氫氧化鈉4mL，用60%乙醇稀釋至10mL，搖勻，靜置10min。同時(shí)取各對(duì)照品溶液5mL，加60%乙醇稀釋至10mL，靜置10min，作為空白。采用分光光度法，在波長(zhǎng)505nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）值對(duì)濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=6.4430C+0.0001，r=0.9999，線性范圍為32.64 ～163.2μg/mL。

2.1.3 樣品測(cè)定 精密吸取供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品溶液的吸光度值，測(cè)定3 次，取其平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算供試品溶液中苦碟子總黃酮的含量。

2.2 苦碟子總黃酮的提取工藝

2.2.1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，選擇影響苦碟子總黃酮提取的加水量、提取時(shí)間、溶液pH 值、醇沉體積4 個(gè)因素，以提取液中苦碟子總黃酮的含量為指標(biāo)，采用L9（34） 正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），優(yōu)選最佳工藝參數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 提取工藝考察 取干燥苦碟子藥材粉末（過(guò)40 目篩）約50g，置圓底燒瓶中，按表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的加水量、提取時(shí)間，加熱回流提取兩次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至相當(dāng)于含生藥1g/mL 的溶液。加鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至規(guī)定值，加規(guī)定體積的90%乙醇充分?jǐn)嚢韬螅潇o置過(guò)夜，離心（2500r/min，5min），取上清液減壓濃縮至無(wú)醇味，加水稀釋至相當(dāng)于含生藥1g/mL 的溶液，測(cè)得其總黃酮含量。

2.2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 各因素的影響程度依次為的主次因素為A ＞D ＞B ＞C，即加水量＞醇沉體積＞提取時(shí)間＞溶液pH 值。本試驗(yàn)結(jié)果分析得出最佳條件為A2B2C2D2，加10 倍量水，加熱回流提取兩次，分別為1h、0.5h，過(guò)濾，合并，濃縮后加鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2，加入4 倍量90%的乙醇進(jìn)行沉淀。方差分析可知，四因素均無(wú)顯著性影響。見(jiàn)表2。

2.2.4 苦碟子總黃酮提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)選得到的最佳工藝條件提取苦碟子總黃酮3 批，減壓濃縮至小體積后冷凍干燥，稱(chēng)定凍干粉重，計(jì)算凍干粉中總黃酮的含量，并計(jì)算轉(zhuǎn)移率，見(jiàn)表3，凍干粉中總黃酮平均含量為15.28%，平均轉(zhuǎn)移率為75.85%，表明該提取醇沉工藝穩(wěn)定、可行、重現(xiàn)性好。

2.3 聚酰胺樹(shù)脂純化苦碟子總黃酮的工藝研究

2.3.1 聚酰胺的預(yù)處理 取聚酰胺樹(shù)脂，過(guò)60 目篩。將樹(shù)脂用蒸餾水充分淋洗，瀝干，用95%乙醇浸泡24h，濕法裝柱；依次用50%，20%乙醇淋洗，洗至不呈白色渾濁為止，再以蒸餾水洗至無(wú)醇味，倒出，置于烘箱中90℃烘干，備用。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 樹(shù)脂粒度的考察 取已處理好的30 ～60目、60 ～80 目、80 ～100 目的聚酰胺樹(shù)脂約5g，濕法裝入內(nèi)徑為1.0cm 的色譜柱中（柱體積約33mL），以2mL/min 的流速，加入60mL 苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5mg/mL 的溶液），收集流出液。精密吸取流出液3mL 加水稀釋至25mL，按2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定流出液中總黃酮的含量，計(jì)算吸附量與吸附率。靜置吸附2h 后，蒸餾水洗脫60mL，棄去；再0.03%氨水洗脫90mL，收集洗脫液，精密吸取1mL放入50mL 容量瓶中加0.03%氨水稀釋至刻度，按2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度值，計(jì)算解吸量與解吸率。見(jiàn)表4。

注：Qa吸附量（mg/g），Ra吸附率（%），Qd解吸量（mg/g），Rd解吸率（%），C0上樣溶液質(zhì)量濃度（mg/mL），Cr流出液質(zhì)量濃度（mg/mL），V 上樣溶液體積（mL），W 干樹(shù)脂質(zhì)量（g），Cd解吸液濃度（mg/mL），Vd解吸液體積（mL）

結(jié)果顯示，隨著聚酰胺粒徑的增大，總黃酮的吸附量及吸附率均呈上升趨勢(shì)，但80 ～100 目聚酰胺的解吸量與解吸率由于形成死吸附而降低，因此選擇動(dòng)態(tài)吸附及解吸率均較最高的60 ～80 目聚酰胺進(jìn)行純化。

2.3.3 上樣溶液濃度的考察 按2.3.2 項(xiàng)下具體操作，以2mL/min 的流速，分別加入總黃酮含量為8.59、5.73、2.29、1.14mg/mL 苦 碟 子 提 取 溶 液（相當(dāng)于將含生藥1g/mL 的溶液分別稀釋至含生藥0.75、0.5、0.2、0.1g/mL 的提取溶液）。收集餾分，每10mL 為一管，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算泄漏率。泄漏率達(dá)10%停止上樣，計(jì)算吸附量與吸附率。靜置吸附2h 后，蒸餾水洗脫60mL，棄去；再0.03%氨水洗脫90mL，收集洗脫液，計(jì)算解吸量與解吸率。見(jiàn)表5。

注：Rl解吸率（%），C0上樣溶液質(zhì)量濃度（mg/mL），Cr流出液質(zhì)量濃度（mg/mL）

表5 上溶液濃度考察結(jié)果

由結(jié)果可見(jiàn)，當(dāng)泄漏率約為10%時(shí)，隨上樣溶液濃度的增加，吸附量增加，并且達(dá)飽和時(shí)間縮短，但是當(dāng)上樣溶液達(dá)到一定濃度時(shí)，由于溶液粘稠，在柱頂形成死吸附而不能解吸，使得解析率反而下降。因此選擇含生藥5.73mg/mL 為最佳上樣溶液濃度（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）的溶液，上樣體積為70mL（約相當(dāng)于2BV）。

2.3.4 上樣流速的考察 按2.3.2 項(xiàng)下具體操作，分別以1、2、3mL/min 的流速上樣，加入苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）。收集流分，每10mL 為一管，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算泄漏率。當(dāng)泄漏率達(dá)10%時(shí)停止上樣，計(jì)算吸附量與吸附率。由表6 可見(jiàn)，流速在1 ～3mL/min 時(shí)，樹(shù)脂的吸附量隨體流速的增大而下降，流速過(guò)大，吸附量下降，提早泄漏；流速過(guò)小，樹(shù)脂的吸附量大，但是達(dá)飽和時(shí)間延長(zhǎng)，工作效率降低。同時(shí)兼顧工作效率和吸附效果，選擇2mL/min 為最佳流速，上樣體積70mL（約相當(dāng)于2BV）時(shí)達(dá)飽和。

表6 上樣流考察結(jié)果

2.3.5 沖洗雜質(zhì)溶劑用量的考察 按2.3.2 項(xiàng)下具體操作，以2mL/min 的流速加入70mL 苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）。飽和吸附后，靜置2h，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。每10mL 為一管，測(cè)定洗脫液中總黃酮含量。結(jié)果顯示，總黃酮在40mL 水洗脫時(shí)產(chǎn)生了流失，之后樹(shù)脂對(duì)黃酮進(jìn)行了很好的富集，不再洗脫下來(lái)。水洗后總黃酮的損失率為3.24%，經(jīng)過(guò)60mL 水洗脫后無(wú)色，可有效的去除極性較大的雜質(zhì)，提高總黃酮純度。見(jiàn)表7。

表7 沖洗雜質(zhì)溶劑用量考察結(jié)果

2.3.6 洗脫溶劑的考察 按2.3.2 項(xiàng)下具體操作，以2 mL/min 的流速加入70mL 苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）。飽和吸附后，靜置2h，先用蒸餾水洗脫60mL，棄去；再分別以30%、50%、70%乙醇水溶液、0.03%氨水各90mL 洗脫，收集洗脫液，計(jì)算解吸量與解吸率。見(jiàn)表8。

表8 洗脫溶劑考察結(jié)果

黃酮類(lèi)化合物解吸常用的洗脫劑有不同濃度乙醇和堿液，試驗(yàn)結(jié)果表明在相同的洗脫體積下，隨著醇濃度的增加，解吸率在增高，但0.03%氨水的洗脫能力最強(qiáng)，解吸率最高。因此選擇0.03%氨水溶液為洗脫劑。

2.3.7 洗脫溶劑體積的考察 按2.3.2 項(xiàng)下具體操作，以0.03%氨水為洗脫溶劑，收集餾分，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算解吸量與解吸率。由表9 結(jié)果可知，隨著洗脫溶劑體積的增加，苦碟子總黃酮的解吸率也隨之增加，但洗脫溶劑用量超過(guò)90mL 后，解吸率增加趨于平緩，因此選擇90mL（約相當(dāng)于3BV）為洗脫溶劑體積。

表9 洗脫溶劑體積考察結(jié)果

2.3.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 按2.3.2 項(xiàng)下具體操作，以2mL/min的流速加入70mL 苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）。飽和吸附后，靜置2h，先用蒸餾水洗脫60mL，棄去；再分別0.03%氨水各90mL 洗脫，收集洗脫液，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算解吸量與解吸率。洗脫液減壓濃縮至小體積后冷凍干燥，稱(chēng)定，計(jì)算總固體物中總黃酮的含量。

由表10 結(jié)果可知，通過(guò)聚酰胺分離純化，凍干粉中苦碟子總黃酮含量可達(dá)51.98 %，比提取醇沉后總黃酮含量15.28%，提高了2.4 倍，說(shuō)明采用聚酰胺樹(shù)脂可以富集純化苦碟子提取物中的總黃酮，轉(zhuǎn)移率為64.15%。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 工藝放大

取已處理好的60～80 目的聚酰胺樹(shù)脂約50g，濕法裝入內(nèi)徑為7.0cm 的色譜柱中（柱體積約360mL），以2mL/min 的流速加入苦碟子提取液（相當(dāng)于含生藥0.5g/mL）2BV。飽和吸附后，靜置2h，先用2BV 蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；再以0.03%氨水洗脫3BV，收集洗脫液。減壓濃縮至小體積后冷凍干燥，稱(chēng)定，計(jì)算總固體物中總黃酮的含量。見(jiàn)表11。

表11 工藝放大結(jié)果

3 討論

苦碟子中主要含有木犀草素、芹菜素等黃酮及其苷類(lèi)化合物，此類(lèi)化合物在70%乙醇中溶解良好，同時(shí)在熱水中有較好的溶解性。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了醇提實(shí)驗(yàn)，采用70%乙醇，10 倍量提取兩次，每次1h，合并兩次提取液，經(jīng)測(cè)定苦碟子總黃酮含量為1.45%，與水提液無(wú)明顯差異。又考慮到水提取較為方便，安全，成本較低，且臨床方劑及原苦碟子注射液的提取工藝也采用水提取的方法，因此本文采用水作為提取溶媒。

本文采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)苦碟子總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提取液中總黃酮含量為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)影響提取工藝的加水量、提取時(shí)間、溶液pH 值和醇沉體積等因素進(jìn)行考察，最終確定最佳的提取工藝條件為：加10 倍量水，加熱回流提取兩次，分別為1h、0.5h，過(guò)濾，合并，濃縮后加鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2，加入4 倍量90%的乙醇進(jìn)行沉淀，離心（2500r/min，5min），取上清液減壓濃縮至無(wú)醇味，加蒸餾水稀釋至相當(dāng)于含生藥0.5g/mL 的溶液（適于聚酰胺純化上樣溶液濃度）。該方法具有能耗小、提取效率高的特點(diǎn)，且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證該工藝穩(wěn)定、可行。

總黃酮的純化一般采用大孔吸附樹(shù)脂[13]、聚酰胺樹(shù)脂[14]以及不同樹(shù)脂聯(lián)用[15-16]等吸附解析的方法。聚酰胺樹(shù)脂是由酰胺聚合而成的一類(lèi)高分子物質(zhì)，它通過(guò)氫鍵和范德華力對(duì)黃酮類(lèi)化合物有較強(qiáng)的吸附性能[17]。本研究對(duì)比了不同粒徑的聚酰胺樹(shù)脂苦碟子總黃酮的吸附能力和解吸附能力，優(yōu)選了60～80 目聚酰胺樹(shù)脂富集苦碟子總黃酮。并采用單因素比較法對(duì)上柱溶液濃度及體積、流速、沖洗雜質(zhì)溶劑用量、洗脫溶劑、洗脫溶劑體積等進(jìn)行了考察，確定了最佳的純化工藝：以2mL/min 的流速加入含生藥0.5g/mL 苦碟子提取溶液2BV，飽和吸附后靜置2h，先用2BV 蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；再以0.03%氨水洗脫3BV，收集洗脫液。經(jīng)放大工藝，苦碟子提取物經(jīng)聚酰胺純化得到的總黃酮含量達(dá)50%以上。

本研究建立了工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可行的苦碟子總黃酮的提取純化方法，為苦碟子總黃酮的進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。