基于網絡藥理學探討潤通萊蜜丸對慢傳輸型便秘小鼠的作用機制

崔長升，齊 濱，劉 莉，張昊旻

(1.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117；2.長春中醫藥大學康復醫學院，長春 130117)

慢傳輸型便秘(slow transit constipaton，STC)是臨床常見的頑固性功能性便秘，其特征是結腸推進力減弱，內容物通過減慢，病因至今尚不清楚[1]。隨著社會經濟的發展，生活節奏加快，精神壓力加重，慢傳輸型便秘的發病率呈增高趨勢[2]。便秘患者在短期內可增加了胃腸道發生腫瘤的風險，其中主要為結腸癌[3]。所以對便秘患者進行早期治療尤為重要。潤通萊蜜丸由萊菔子、白術、枳實、蜂蜜經科學方法精制而成的復方丸劑，具有健脾理氣，潤腸通便等功效，臨床上主要用于治療多種因素導致的STC。

網絡藥理學是以系統生物學和多向藥理學為理論基礎的研究方法，通過構建藥物、靶點、通路、疾病之間的復雜網絡來探討藥物的作用機制[4]。現采用網絡藥理學對潤通萊蜜丸的作用靶點進行預測，再通過動物實驗進行驗證，初步闡明潤通萊蜜丸治療STC的作用機制，為臨床使用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

ICR(institute of cancer research)小鼠，體重為(20±2) g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司；動物等級：SPF級；合格證編號為SCXK(吉)2016-0003。

1.2 實驗藥物

白術、萊菔子、枳實配方顆粒均購自廣東一方制藥有限公司，批號：720331；鹽酸洛哌丁胺膠囊為西安楊森制藥有限公司產品，批號：180726655；枸櫞酸莫沙必利片為江蘇豪森藥業集團有限公司產品，批號：181003。

潤通萊蜜丸由白術40份、萊菔子40份、枳實40份、蜂蜜500份，加熱160 ℃，攪拌10 min，形成濃稠液體，冷卻至30 ℃，取5 g制成丸劑，再次冷卻4 ℃保存待用。

1.3 實驗試劑

蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒，購自Solarbio；cox-1、cox-2試劑盒購自上海優選生物科技有限公司；甲醛、二甲苯均購自北京化工廠。

1.4 實驗設備

高速冷凍離心機[ST-40R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；酶標儀(Infinite M200 Pro型)；輪轉切片機(RM2245型，德國萊卡測量系統設備有限公司)；自動包埋機(EG1150H型，德國萊卡測量系統設備有限公司)；烘片機(HI1220型，德國萊卡測量系統設備有限公司)；鋪片機(HI1210型，德國萊卡測量系統設備有限公司)；三用恒溫水浴槽(DK-420S，上海精宏實驗設備有限公司)；體視顯微鏡(尼康SMZ25型，北京瑞科中儀科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 網絡藥理學預測潤通萊蜜丸治療STC的靶點

2.1.1 白術、枳實、萊菔子成分收集、活性化合物及靶標蛋白的篩選

借助中藥系統藥理學分析平臺(Chinese medicine system pharmacology analysis platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分別以“白術”“枳實”“萊菔子”為關鍵詞檢索白術、枳實、萊菔子中的化學成分。篩選出白術、枳實中符合生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18及萊菔子中符合OB≥30%和DL≥0.15作為活性成分及收集其對應的相關靶標蛋白。

2.1.2 疾病基因的篩選

通過GenCards(https://www.genecards.org/)數據庫，以“slow transit constipaton”為關鍵詞檢索與STC相關的基因。

2.1.3 白術、枳實、萊菔子作用靶點與慢傳輸型便秘相關靶點交集

利用在線Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪圖軟件繪制潤通萊蜜丸作用靶點與STC相關靶點交集基因的Venny圖。

2.1.4 活性成分-靶點網絡構建

利用cytoscape(3.7.1)(https://cytoscape.org/)軟件構建化學成分-靶點網絡，探討潤通萊蜜丸治療STC的作用機制。

2.2 潤通萊蜜丸對STC的治療作用及機制

2.2.1 分組及模型制備

取小鼠50只，分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、低劑量組、高劑量組，每組10只。空白對照組，予以蒸餾水(0.1 mL/10 g)灌胃，其余組按鹽酸洛哌丁胺膠囊(1.5 mg/kg)經口灌胃，每天2次，連續灌胃21 d[5]。造模成功后，空白對照、模型對照組，給予蒸餾水(0.4 mL/20 g)灌胃；陽性對照組給予枸櫞酸莫沙必利片(2.5 mg/kg)經口灌胃；低劑量組、高劑量組給予潤通萊蜜丸(25 mg/10 g、50 mg/10 g)經口灌胃(灌胃前用蒸餾水將潤通萊蜜丸稀釋成液體)，每天2次，共7 d。

2.2.2 測定小腸炭末推進率

在治療第7 d，禁食不禁水24 h后，給予各組小鼠炭末汁0.4 mL，炭末汁灌胃完成后即開始記錄時間，30 min后小鼠脫頸處死，腸管總長度為幽門至所剪回盲處長度，炭末推進長度為從幽門至炭末汁前端處。小腸炭末推進率(%)=炭末推進長度(cm)/腸管總長度(cm)×100%。打開腹腔，觀察小鼠結腸內糞便性狀、計算結腸內大便粒數。

2.2.3 小鼠結腸病理結構的觀察

選取小鼠結腸近肛門部位長約2 cm結腸組織，生理鹽水沖洗，10%中性甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋，常規切片，HE染色，顯微觀察。

2.2.4 小鼠結腸組織cox-1、cox-2的測定

取出的結腸組織按照器官1∶9(m/V)的比例加入冷生理鹽水，勻漿器冰浴研磨制備成10%的結腸組織勻漿，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，低溫保存，含量測定均按照cox-1、cox-2試劑盒說明書的方法進行。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 成分收集、活性化合物及靶標蛋白的篩選

通過TCMSP 檢索到白術、枳實、萊菔子中化合物172個，其中55個來自白術，65個來自枳實，52個來自萊菔子。以OB≥30%和DL≥0.18，篩選出活性化合物35個，其中7個來自白術，22個來自枳實，6個來自萊菔子。35個活性化合物的基本信息如表1所示。

3.2 疾病基因的篩選

通過GenCards(https://www.genecards.org/)數據庫，以“slow transit constipaton”為關鍵詞檢索與STC相關的基因，共篩選得到1 822個相關基因。

3.3 潤通萊蜜丸作用靶點與STC相關靶點交集

利用在線Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪圖軟件繪制潤通萊蜜丸作用靶點與STC相關靶點交集基因的Venny圖，共得到42個交集基因。結果如圖1所示。

圖1 潤通萊蜜丸作用靶點與STC相關靶點交集Fig.1 The intersection of the target of Runtonglaimi pill and the target of STC

表1 35個活性化合物的OB及DLTable 1 OB and DL of 35 active compounds

3.4 活性成分-靶點網絡構建

利用35個活性成分和42個靶點的關系構建活性成分-靶點網絡圖(圖2)。有14個化合物未參與網絡繪制。其中枳實中木犀草素、香蜂草苷、柚皮素可分別與21、16、12個靶點基因有連接，白術中白術內酯I可與4個靶點基因連接，萊菔子中谷甾醇可與2個靶點基因連接。靶點基因中連接度最高的是PTGS1，可與14個活性成分連接，PRSS1、PPARG、ESR1、ESR2、ACHE均可與5個以上的活性成分有連接，由此可知，潤通萊蜜丸可能主要通過調節PTGS1治療STC的。

圖2 活性成分-靶點網絡圖Fig.2 Active ingredient-target network diagram

3.5 潤通萊蜜丸對小鼠小腸推進率的影響

如表2所示，與空白組相比，模型組小鼠炭末推進率明顯降低(P<0.01)，說明鹽酸洛哌丁胺使小鼠腸道蠕動減弱，傳輸功能降低，造模成功；與模型組相比，陽性對照組、低劑量組、高劑量組小鼠的炭末推進率均增高，具有極顯著差異(P<0.01)。

表2 潤通萊蜜丸對便秘小鼠小腸碳末推進率的影響Table 2 Effect of Runtonglaimi pill on the intestinal carbon adduction rate of constipation

注：##，與空白組相比,P<0.01；**，與模型組相比,P<0.01。

3.6 潤通萊蜜丸對小鼠結腸內大便粒數的影響

如表3所示，與空白組相比，模型組小鼠結腸內大便粒數明顯增加(P<0.01)，說明鹽酸洛哌丁胺使小鼠結腸中大便滯留；觀察發現，模型組小鼠結腸內大便，質地堅硬，顏色為黑色。陽性對照組、低劑量組、高劑量組小鼠結腸中大便粒數明顯減少，具有極顯著差異(P<0.01)，大便顏色無明顯變化。

表3 潤通萊蜜丸對便秘小鼠結腸內大便粒數的影響Table 3 Effect of Runtonglaimi pill on the number of stool in the colon of constipation

注：##,與空白組相比,P<0.01；**，與模型組相比，P<0.01。

3.7 潤通萊蜜丸對小鼠結腸形態結構的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，模型對照組小鼠結腸黏膜紊亂，肌層明顯變薄，并有炎性細胞浸潤；與模型組相比，陽性對照組、低劑量組、高劑量組小鼠結腸內黏膜排列正常，高劑量組肌層厚度正常。

圖3 潤通萊蜜丸對小鼠結腸形態結構的影響Fig.3 Effect of Runtonglaimi pill on colonic morphology of mice

3.8 潤通萊蜜丸對結腸組織中cox-1、cox-2表達量的影響

與正常對照組比較，模型對照組小鼠結腸組織中cox-1、cox-2含量明顯升高，有極顯著性差異(P<0.01)。與模型組相比，陽性藥組、潤通萊蜜丸低高劑量組均可降低cox-1、cox-2含量(P<0.01)。試驗結果如表4所示。

表4 潤通萊蜜丸對慢性傳輸型便秘小鼠結腸中cox-1、cox-2表達的影響Table 4 Effect of Runtonglaimi pill on the expression of cox-1 and cox-2 in colon of mice with chronic

注：**，與正常對照組比較差異極顯著，P<0.01；△，與模型對照組比較差異顯著，P<0.05；△△，與模型對照組比較差異極顯著，P<0.01。

4 討論與結論

中醫藥強調四診合參、整體辨證，注重調整人體氣血津液平衡、臟腑陰陽，因人施治，個體化治療，在治療便秘方面歷史久遠，在臨床應用中取得了一定的效果[6]。以行氣導滯，潤腸通便立法，以萊菔子健脾消食，行氣導滯為君藥，以蜂蜜補氣溫中、潤燥通便為臣藥，佐以枳實健脾行氣，佐以白術健脾益氣。諸藥配伍，共奏行氣潤腸之功效，以通腑中郁滯，臨床上用以治療多種因素導致的便秘，對治療慢傳輸型便秘的患者，效果尤為顯著。

在治療效果考察方面，通過對慢傳輸型便秘小鼠給予潤通萊蜜丸治療后發現，潤通萊蜜丸可提高慢傳輸型便秘小鼠小腸炭末推進率、減少結腸中大便粒數，減少結腸結構中炎性細胞的浸潤，恢復結腸的正常結構。

在作用機制研究方面，利用網絡藥理學首先對潤通萊蜜丸進行了作用靶點進行預測，共有21個化合物和42個靶點參與了網絡構建，通過網絡圖分析，共有14個活性成分與PTGS1有連接，據此推測潤通萊蜜丸可能主要通過調節PTGS1緩解STC的。PTGS為環氧合酶，其存在兩種同工酶，即PTGS1(cox-1)和PTGS2(cox-2)，兩個亞型基本蛋白結構相似，二者與結直腸癌的發生密切相關[7]。環氧化酶(COX)及其產物參與機體的腫瘤新生、血壓調節、炎癥反應、凝血平衡等多種生理和病理過程，近年來研究發現COX對腸道運動過程發揮著重要作用[8]。炎癥正在成為癌癥的一個新標志，花生四烯酸(AA)代謝、環氧化酶家族(COXs)和脂氧合酶(LOX)在AA相關炎癥級聯中起重要作用，在結腸癌樣本中環氧化酶家族(COXs)存在高表達狀態[9]，所以對cox-1、cox-2均進行了考察。目前研究者們對治療慢傳輸性便秘的機制主要從c-kit[10]、NO[11]、eNOS[12]、水通道蛋白[13]等方面進行了研究，但對cox-1、cox-2研究較少。因此分別對空白對照組、模型對照組、陽性對照組、低劑量組、高劑量組小鼠結腸中cox-1、cox-2的表達量進行了檢測，結果表明，潤通萊蜜丸低高劑量組均可降低慢傳輸型便秘小鼠結腸中cox-1、cox-2含量。說明潤通萊蜜丸可以通過調節cox-1、cox-2緩解慢傳輸型便秘的，此外為研究慢傳輸型便秘提供了新思路。