偏振成像的乳腺癌病理切片檢測(cè)方法

田博文，黃丹飛*，鐘艾琦，王雄才，孫雪峰，張玉爽，趙麗穎，王 震，宋 東

(1.長(zhǎng)春理工大學(xué)光電工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，長(zhǎng)春 130022)

運(yùn)用偏振光學(xué)成像技術(shù)對(duì)生物組織進(jìn)行表征,有著快速、低損傷、高分辨率的并能提供比非偏振光學(xué)方法更豐富的組織結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)[1]。生物組織可以類比作一個(gè)具有多種復(fù)雜偏振作用的光學(xué)元件，其對(duì)入射光偏振態(tài)的作用全部都包括在表征生物組織特性的Mueller矩陣中,依據(jù)前人的研究,目前所認(rèn)可的包括二向色性、相位延遲、散射退偏、起偏特性、方位角變化等[2]。為了獲得這些反映組織微觀結(jié)構(gòu)的特征參數(shù)，就要運(yùn)用Mueller矩陣分解的方法從Mueller矩陣16個(gè)陣元中分離提取出只體現(xiàn)本征屬性的成像參數(shù)[3]。利用Mueller矩陣分解參數(shù)對(duì)組織進(jìn)行表征，對(duì)于確定病變組織區(qū)域的惡性生長(zhǎng)邊緣以進(jìn)行精確的手術(shù)切除或在活檢過程中進(jìn)行快速輔助診斷有著很好的發(fā)展空間[4]。21世紀(jì)初，Chung等[5]運(yùn)用Mueller矩陣分解參數(shù)對(duì)口腔癌變組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相關(guān)參數(shù)能夠區(qū)分癌變與非癌變組織。Pierangelo等[6]總結(jié)了對(duì)腸癌組織的Mueller矩陣分解參數(shù)，發(fā)現(xiàn)其相位延遲參數(shù)和散射退偏參數(shù)可以區(qū)分癌變和非癌變組織。此后，Pierangelo等[7]再次提出Mueller矩陣分解參數(shù)可以輔助診斷不同階段的宮頸上皮瘤組織。但國(guó)外針對(duì)乳腺癌的這方面研究甚少，中國(guó)則幾乎沒有。

近年來乳腺癌一直位居于女性惡性腫瘤的第一位，其發(fā)病率在女性中約占10.4%[8]。隨著乳腺癌治療理念和方法的變化，乳腺癌的快速病理診斷已經(jīng)成為臨床病理檢測(cè)的重要應(yīng)用點(diǎn)[9]。病理切片的顯微觀測(cè)仍然是病理評(píng)估的“金標(biāo)準(zhǔn)”，由于光學(xué)顯微鏡只能對(duì)經(jīng)染色處理過的切片觀測(cè)才能判斷癌變組織和正常組織的區(qū)別，所以病變部位需要取樣冰凍后染色制成切片，病理切片的染色制作一定程度上會(huì)增加病理檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)。如果檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性,還需重新送檢，大大延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)。因此，臨床上亟需一種快速、客觀、準(zhǔn)確的病理切片評(píng)判方法，來區(qū)分癌變與非癌變組織。

利用偏振光成像快速非染色檢測(cè)并能準(zhǔn)確表征生物組織微觀結(jié)構(gòu)差異的優(yōu)點(diǎn)，提出了一種基于偏振成像的乳腺癌病理切片檢測(cè)的方法。首先設(shè)計(jì)并搭建了測(cè)量組織背向散射光Mueller矩陣的自動(dòng)化成像系統(tǒng)。隨后對(duì)未染色的乳腺癌組織病理切片分別進(jìn)行Mueller矩陣成像，最后對(duì)所得到的樣本Mueller矩陣圖像進(jìn)行分解計(jì)算，提取出具有清晰物理意義且反映組織樣本微觀結(jié)構(gòu)的特征參數(shù)圖像，來區(qū)分癌變非癌變組織。以期為偏振光在乳腺癌的快速病理診斷提供了一種新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

主動(dòng)偏振成像系統(tǒng)才能獲取待測(cè)樣本Mueller矩陣，所以需要對(duì)已知光波進(jìn)行不同偏振態(tài)的調(diào)制后入射到待測(cè)樣本，相應(yīng)的對(duì)于每種偏振態(tài)的入射光也都要按照不同偏振態(tài)進(jìn)行檢偏。偏振光的調(diào)制方法目前有兩種類型，相位延遲調(diào)制和機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)制[10]。相位延遲調(diào)制是通過改變偏振器件的相位延遲量來對(duì)光波進(jìn)行調(diào)制，最為典型的為液晶可變相位延遲器(liquid crystal variable retarder，LCVR)，但其容易受到溫度等外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致測(cè)量時(shí)間不能過長(zhǎng)，且每次使用前都需要進(jìn)行標(biāo)定。考慮到這些因素，采用機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)制中的雙旋轉(zhuǎn)波片法(double rotating retarders，DDR)[11],由PLC驅(qū)動(dòng)電控旋轉(zhuǎn)臺(tái)帶動(dòng)兩個(gè)1/4波片以恒定的角速度旋轉(zhuǎn)特定角度來實(shí)現(xiàn)對(duì)光波偏振態(tài)的調(diào)制，該成像系統(tǒng)示意如圖1所示。該系統(tǒng)由中心波長(zhǎng)為630 nm的LED陣列光源(LIU630A，美國(guó)ThorLabs)，光闌，毛玻璃屏L1，線偏振片P1和P2(LPVISC100-MP2-SM1，美國(guó)ThorLabs)，電控旋轉(zhuǎn)臺(tái)W1和W2(MAS102,北光世紀(jì)),1/4波片Q1和Q2(膠合零級(jí)波片，武漢優(yōu)光科技)，成像透鏡L2和CMOS相機(jī)，以及PLC控制系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成。其中，PLC控制系統(tǒng)包括兩個(gè)二相混合式驅(qū)動(dòng)器(SJ-2H504DM，常州雙杰)和一個(gè)PLC控制板(FX2N-14MT，國(guó)產(chǎn)三菱)。

圖1 成像系統(tǒng)示意圖Fig.1 Imaging system diagram

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)選取的樣本為未染色的乳腺癌組織切片，厚度為4 μm。LED陣列光源出射的光經(jīng)過光闌，并經(jīng)由毛玻璃屏勻光后，進(jìn)入到由線偏振片P1和架設(shè)在電控旋轉(zhuǎn)臺(tái)W1上的1/4波片Q1構(gòu)成的起偏器(polarization state generator,PSG)。先經(jīng)由PSG調(diào)制的偏振光照射到待測(cè)組織切片，再通過待測(cè)組織的散射進(jìn)入到由P2和架設(shè)在W2上的Q2所構(gòu)成的檢偏器(polarization state analysis,PSA)。成像時(shí)，固定P1和P2，透振方向?yàn)樗椒较颍琎1和Q2的快軸方向與其保持一致，計(jì)算機(jī)與PLC控制系統(tǒng)建立通訊來驅(qū)動(dòng)電控旋轉(zhuǎn)臺(tái)W1、W2帶動(dòng)Q1、Q2每次以1∶5的角度從0°開始以6°和30°的步長(zhǎng)旋轉(zhuǎn)30次，CMOS相機(jī)記錄每次旋轉(zhuǎn)獲得的光強(qiáng)變換圖像并傳輸?shù)诫娔X中，然后根據(jù)光強(qiáng)傅里葉系數(shù)求得樣本Mueller矩陣的各個(gè)元素，最后運(yùn)用Mueller矩陣分解對(duì)所得的Mueller矩陣進(jìn)行計(jì)算得出能夠代表樣本微觀結(jié)構(gòu)的參數(shù)圖像，單次實(shí)驗(yàn)成像時(shí)間為分鐘。

1.3 實(shí)驗(yàn)原理

1.3.1 Mueller矩陣

Stokes矢量是一種簡(jiǎn)單的描述光波偏振態(tài)的數(shù)學(xué)表達(dá)形式，為一個(gè)包含四個(gè)參數(shù)的列向量，用[S0S1S2S3]T表示。Stokes矢量通常和Mueller矩陣一起表示表征光的偏振態(tài)和物質(zhì)的偏振特性[12]。Mueller矩陣為一個(gè)4×4的矩陣，用M表示，Stokes矢量與Mueller矩陣之間的關(guān)系為Sout=MSin，其中Sin和Sout分別表示系統(tǒng)入射光和出射光的Stokes矢量[13]。在圖1的成像系統(tǒng)中入射光為Sin=[1,0,0,0]T,經(jīng)過PSG調(diào)制后從待測(cè)組織(Mueller矩陣為MTissues)出射進(jìn)入PSA，那么最后測(cè)得的出射光強(qiáng)表示為

Sout=MPSAMTissuesMPSGSin

(1)

MPSG=MP1MP2

(2)

MPSA=MP2MQ2

(3)

式中：MP和MQ分別為理想偏振片和波片的Mueller矩陣。為了進(jìn)一步理解，可以把偏振器和檢偏器看作一個(gè)整體，則可以令A(yù)=MPSA,G=MPSGSin則式(1)可表示為

Sout=AMTissuesG

(4)

實(shí)驗(yàn)中CMOS相機(jī)所探測(cè)到的為樣本組織經(jīng)過散射后的光強(qiáng)Iout為Sout的第一個(gè)分量，則根據(jù)矩陣的運(yùn)算關(guān)系，Iout大小與A的第一行元素有關(guān)。令ai為A的第一行元素，gj為G的所有元素，在經(jīng)過展開合并后，可得：

(5)

根據(jù)雙波片的快軸旋轉(zhuǎn)角度α比，可以求出矩陣u：

(6)

再由傅里葉變化可得:

(7)

由式(7)可知，Iout的傅里葉系數(shù)與待測(cè)組織Mueller矩陣MTissues中各元素Mij成函數(shù)關(guān)系，利用傅里葉變換后的變換系數(shù)an、bn，通過計(jì)算可求得待測(cè)組織的Mueller矩陣：

(8)

1.3.2 Mueller矩陣分解

Mueller矩陣分解是通過對(duì)樣本的Mueller矩陣進(jìn)行計(jì)算從而提取出具有明確物理意義的成像參數(shù)的方法，Lu-Chipman Mueller矩陣分解方法[13](mueller matrix decomposition,MMD)是目前最為廣泛應(yīng)用的分解方法。該方法將樣本的Mueller矩陣分解成三個(gè)子矩陣相乘的形式，如式(9)所示，分別對(duì)應(yīng)樣本的二向色性、相位延遲和散射退偏。

M=MΔMRMD

(9)

下面給出了相關(guān)參數(shù)的表達(dá)式，其詳細(xì)的推導(dǎo)過程可參考文獻(xiàn)[14]，首先對(duì)式(8)所得待測(cè)組織的Mueller矩陣進(jìn)行歸一化得：

(10)

二向色性：

(11)

散射退偏：

(12)

線性相位延遲:

δ=cos-1({[MR(2,2)+MR(3,3)]2+

[MR(3,2)-MR(2,3)]2}1/2-1)

(13)

2 結(jié)果

2.1 Mueller矩陣

根據(jù)組織病理學(xué)可將乳腺癌分為原位癌和浸潤(rùn)癌兩個(gè)大類。有關(guān)研究表明，在電鏡下乳腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征為細(xì)胞具有高度的異型性，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見張力原纖維絲[15]。偏振成像有著對(duì)亞波長(zhǎng)微觀結(jié)構(gòu)變化十分敏感的特點(diǎn)，所以對(duì)這種異型性則會(huì)表征出偏振特性差異[16]。在病理切片上選擇了由吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院乳腺外科所提供的未染色乳腺原位癌對(duì)照切片和未染色浸潤(rùn)性乳腺癌乳頭狀瘤對(duì)照切片進(jìn)行Mueller矩陣成像實(shí)驗(yàn)。

如圖2所示為乳腺原位癌的Mueller矩陣成像結(jié)果。其中，圖2(a)為實(shí)驗(yàn)所使用的乳腺原位癌對(duì)照，對(duì)照部分(圓形區(qū)域)為正常組織。圖2(b)為切片的強(qiáng)度圖像，由于CMOS相機(jī)前置鏡頭使其成放大的鏡像,對(duì)照部分變?yōu)榱俗髠?cè)部分。圖2(c)是強(qiáng)度偽彩色圖像。圖2(d)是乳腺原位癌對(duì)照切片Mueller矩陣，其每個(gè)陣元均用m00做歸一化處理。

如圖3所示為浸潤(rùn)性乳腺癌和乳頭狀瘤Mueller矩陣成像。圖3(a)為浸潤(rùn)性乳腺癌和乳頭狀瘤切片，上方紅色方框區(qū)域?yàn)槿轭^狀瘤組織，下方黃色方框區(qū)域?yàn)榻?rùn)性乳腺癌組織，剩余部分為正常組織；圖3(b)為切片的強(qiáng)度圖像；圖3(c)是強(qiáng)度偽彩色圖像。圖3(d)為浸潤(rùn)性乳腺癌和乳頭狀瘤切片Mueller矩陣，其每個(gè)陣元均用m00做歸一化處理。

圖2 乳腺原位癌Mueller矩陣成像Fig.2 Mueller matrix imaging of breast carcinoma in situ

圖3 浸潤(rùn)性乳腺癌和乳頭狀瘤Mueller矩陣成像Fig.3 Mueller matrix imaging of invasive breast cancer and papilloma

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，未染色病理切片的強(qiáng)度圖像癌變組織和正常組織并沒有明顯區(qū)別。與之相比較，圖2(d)和圖3(d)Mueller矩陣中對(duì)角線上陣元m11、m22、m33正常和癌變組織有明顯區(qū)別，癌變部分呈現(xiàn)出較高的強(qiáng)度值，這是因?yàn)榘┳兘M織和正常組織的微觀結(jié)構(gòu)的差異被表征出不同的偏振特性。但是具體的偏振特性需要通過Mueller分解的方法來得出。

2.2 Mueller矩陣分解

利用Mueller矩陣分解對(duì)上面所得到的病理切片的Mueller矩陣進(jìn)行分解，可以得到Mueller矩陣的分解參數(shù)(散射退偏Δ，線性相位延遲δ，二向色性D)，圖4所示，為乳腺原位癌對(duì)照切片的Mueller矩陣分解結(jié)果。圖4(a)為散射退偏Δ，正常區(qū)域Δ要高于癌變區(qū)域，均在0.4以上，這表明在癌變過程中組織細(xì)胞形態(tài)的改變導(dǎo)致組織散射退偏能力下降；圖4(b)為線性相位延遲δ，癌變區(qū)域的δ高于正常區(qū)域均在0.35以上，這說明癌變區(qū)域比正常區(qū)域有更強(qiáng)的雙折射效應(yīng)，這是由于癌變過程中組織纖維化造成的；圖4(c)為二向色性D，癌變區(qū)域和正常區(qū)域的值都趨近于0，無法區(qū)分癌變和非癌變區(qū)域。

圖4 乳腺原位癌切片Mueller矩陣分解結(jié)果Fig.4 MMD results of breast cancer in situ section

圖5為浸潤(rùn)性乳腺癌和乳頭狀瘤切片 Mueller矩陣分解結(jié)果。圖5(a)為散射退偏Δ，癌變區(qū)域[圖3(b)中紅色方框乳頭狀瘤區(qū)域和黃色方框浸潤(rùn)性乳腺癌區(qū)域]呈現(xiàn)出較低的Δ，接近于0.2左右，正常區(qū)域Δ均在0.5以上。同樣表明病變過程中組織細(xì)胞形態(tài)的改變導(dǎo)致組織散射退偏能力下降；圖5(b)為線性相位延遲δ，癌變區(qū)域δ明顯高于正常組織區(qū)域。此外，乳頭狀瘤區(qū)域相比浸潤(rùn)性乳腺癌區(qū)域呈現(xiàn)出更高的強(qiáng)度，達(dá)到0.6以上。表明了乳頭狀瘤區(qū)域相比侵潤(rùn)性乳腺癌區(qū)域有著更強(qiáng)的雙折射效應(yīng)。圖5(c)為二向色性D，癌變區(qū)域和正常區(qū)域的值都趨近于0，無法區(qū)分癌變和非癌變區(qū)域。

圖5 浸潤(rùn)性乳腺癌和乳頭狀瘤切片Mueller矩陣分解結(jié)果Fig.5 MMD results of invasive breast cancer and papilloma sections

3 結(jié)論

(1)運(yùn)用雙旋轉(zhuǎn)波片法(DDR)，設(shè)計(jì)并搭建了一套乳腺癌病理切片的Mueller矩陣自動(dòng)成像系統(tǒng)，系統(tǒng)整體由PLC控制。

(2)以乳腺原位癌對(duì)照切片和浸潤(rùn)性乳腺癌乳頭狀瘤對(duì)照切片為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行Mueller矩陣成像，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)能夠正確對(duì)病理切片進(jìn)行成像，癌變組織和非癌變組織有明顯的偏振特性差異，單次成像時(shí)間為2 min。

(3)對(duì)上述兩類切片的Mueller矩陣圖像進(jìn)行分解，得到Mueller矩陣分解參數(shù)圖像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乳腺原位癌組織相比正常組織散射退偏能力較低，而雙折射能力較強(qiáng)；浸潤(rùn)性乳腺癌和乳頭狀瘤組織有相同的特性，此外乳頭狀瘤組織比浸潤(rùn)性乳腺癌組織有著更強(qiáng)的雙折射能力；相比于強(qiáng)度成像散射退偏參數(shù)Δ和線性相位延遲參數(shù)δ能夠區(qū)分癌變區(qū)域和正常區(qū)域。為乳腺癌的病理切片快速有效檢測(cè)提出了新的參考方法。