葛瑞林對膿毒癥致急性肺損傷小鼠炎癥反應的效果及機制研究

周 虹，崔 娟，陸 尤，孫 晶，孫力超，李 彥★

（1.應急總醫院 急診科，北京 100028；2.應急總醫院 藥學部，北京 100028；3.中日友好醫院 急診科，北京 100029）

膿毒癥即全身炎癥反應綜合征 （systemic in-flammatory response syndrome，SIRS），是一種潛在致命性的全身炎癥，由嚴重感染引起[1]。有研究顯示約40%的膿毒癥患者出現急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[2]。膿毒癥的發生歸因于宿主對感染的初始反應被級聯放大并對宿主造成損傷。膿毒癥的炎癥反應過程是由激活的各種炎癥細胞參與的復雜過程[3]。葛瑞林（Ghrelin）是一種28 個氨基酸的胃腸肽激素，具有廣泛的生物活性，可促進生長激素的釋放、影響脂肪和能量代謝、改善胰島素抵抗。另有研究也表明它可增強機體的免疫及抗炎能力[4]。此前有研究報道，葛瑞林可減輕實驗動物急性胰腺炎和結腸炎的炎癥反應[5，6]，并可通過影響Akt 的活性減弱膿毒癥所致的腦損傷[7]。本研究旨在探討葛瑞林對膿毒癥所致ALI 是否具有保護作用及其發揮作用的可能機制。

1 材料與方法

健康SPF 級C57BL/6 小鼠80 只（雌性、雄性各40 只），購買自SLRC 實驗室（上海），鼠齡8～10 周， 體質量18～22g。將小鼠飼育在SPF 屏障內，在22°C～25°C 室溫下保持每隔12h 的光/暗循環并自由飲水進食。葛瑞林，Ghrelin，購自吉爾生化上海有限公司，批號：20180812， 規格：5mg。

1.1 實驗動物、分組

參照Rittirsch D 等使用盲腸結扎穿刺術（the cecal ligation and puncture，CLP）的方法[8]制作膿毒癥小鼠動物模型。小鼠在實驗前12h 禁食，自由飲水。小鼠40mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，下腹部消毒、 備皮無菌操作， 在下腹部正中央切口，長約0.5～1.0cm，打開腹腔尋找盲腸，小心分離其遠端與大腸的系膜， 實驗組將盲腸結扎在回盲瓣下方，并用無菌21 號針頭在已結扎盲腸遠段中央處貫通穿孔，然后把盲腸推回腹腔，關閉腹腔，逐層縫合； 對照組僅做開腹分離盲腸遠端與大腸的系膜及關腹手術。術后按50ml/kg 體重皮下注射生理鹽水， 補充術中丟失的液體， 連續觀察24h，整個實驗在室溫（22°C～25°C）下進行。

C57BL/6 小鼠80 只， 按隨機數字法分為4組： 假手術動物 （對照組）、CLP 誘導膿毒癥組（CLP 組）、 以磷酸鹽緩沖鹽 （PBS） 為溶媒治療CLP 組 （CLP+PBS 組） 和葛瑞 林治療CLP 組（CLP+葛瑞林組），每組均為20 只。除對照組外其他組均建立膿毒癥模型并誘導ALI。術后2d 內，葛瑞林治療組和PBS 治療組小鼠腹膜內注射葛瑞林（80μg/kg/d，溶于PBS）和PBS 2ml（pH 7.2～7.4）。

1.2 取材和肺損傷的評定

術后d5，各組小鼠用CO2窒息法處死。取小鼠右肺一葉固定于4%多聚甲醛中，乙醇脫水，石蠟包埋切片。一部分經HE 染色，光鏡觀察染色區域病理變化。單盲法評估肺組織的損傷程度。肺損傷的評分依據肺泡充血、出血、血管壁內或壁間中性粒細胞浸潤或聚集以及肺泡壁/透明膜形成的厚度。得出的平均值作為肺損傷的半定量組織學指標[9]。

1.3 髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的測量

組織中MPO 活性參考Hillegass 等人[10]描述的程序來測定。肺組織制成勻漿，并將含有MPO的上清液與含有底物H2O2（1.5mmol）和鄰聯茴香胺二鹽酸鹽（167mg/ml，Sigma Aldrich）的50mmol KPO4緩沖液孵育30min。最后，使用96 孔板讀數測量460nm 處吸光度的變化來測定酶活性。

1.4 支氣管肺泡灌洗液 （bronchialveolar lavage fluid，BALF）細胞計數

氣管暴露并用導管插管。左肺用無菌PBS 沖洗3 次， 每次0.5ml。灌洗后液體回收率平均＞90%。BALF 在4°C 下以2000rpm 離心10min，上清液在-80°C 下儲存用于細胞因子和蛋白質分析， 細胞團塊則重新懸浮在PBS 中用于細胞計數。

1.5 ELISA 測定炎性細胞因子

使用ELISA 試劑盒（USCNLIFE，中國武漢）檢測BALF 中炎性細胞因子， 包括TNF-α、IL-6、IL-1β 和巨噬細胞炎性蛋白2 （macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）的產生。將樣品分3份分析，結果為3 次獨立實驗的x－±s。

1.6 Western blotting 分析

使用RIPA 裂解液低溫勻漿裂解各組小鼠的肺組織勻漿30min，4℃12000rpm 離心20min，收集上清即得總蛋白溶液， 用Bradford 法測定樣品蛋白濃度。取20μg 蛋白樣品，經SDS-PAGE 電泳分離后轉移至PVDF 膜上， 然后按照一抗（包括Akt、p-Akt 和β-actin）孵育，與辣根過氧化物酶結合的二抗雜交后用ECL 化學發光成像檢測肺組織中Akt 和磷酸化的Akt。所有樣品分3 份檢測。

1.7 生存曲線

為了評價葛瑞林對膿毒癥致ALI 小鼠存活的影響， 將對照組、CLP 組、CLP+PBS 組和CLP+葛瑞林組各取10 只小鼠， 每24h 進行存活率的測定，直到120h 的終點。

1.8 統計學方法

應用SPSS 16.0 軟件進行統計學分析。符合正態分布的結果表示為均數±標準差（x－±s）。采用單因素方差分析、Fisher 最小顯著差異檢驗分析組間差異。采用Kaplane Meier 分析測定存活率。

2 結果

2.1 對膿毒癥ALI 的病理學損傷的影響

HE 染色后觀察組織病理學變化， 正常對照組的小鼠沒有明顯的組織形態學損傷（圖1A，見封二）， 與對照組相比，CLP 組的肺組織表現出顯著的病理學異常（圖1B，見封二），包括肺泡出血、肺泡壁增厚、 大量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤于肺泡腔內及壁間。與CLP 組和CLP+PBS 組 （圖1C，見封二）相比，葛瑞林治療組（圖1D，見封二）的肺組織病理學損傷顯著減輕。

表1 各組小鼠肺損傷指數、MPO 活性和BALF 炎性細胞總數

圖2 各組小鼠BALF 中促炎細胞因子表達的變化

圖3 葛瑞林對膿毒癥ALI 小鼠肺組織Akt 磷酸化的影響

圖4 葛瑞林治療改善膿毒癥致ALI 小鼠的生存率

各組小鼠肺損傷指數、MPO 活性和浸潤的炎性細胞計數見表1。與CLP 組和CLP+PBS 組相比， 葛瑞林治療組可顯著降低肺損傷指數、 肺的MPO 活性和BALF 中炎性細胞浸潤數量 （均P＜0.05）。

2.2 對BALF 中炎性細胞因子產生的影響

BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β 和MIP-2 的濃度， 如圖2 所示， 在經過葛瑞林處理的小鼠肺BALF（治療組）中，炎性細胞因子的產生，包括TNF-α （圖2A）、IL-6 （圖2B）、IL-1β （圖2C）和MIP-2（圖2D），與CLP 組和CLP+PBS 組相比顯著降低（均P＜0.05）。

2.3 對激活Akt 信號傳導通路的影響

Western blot 結果見圖3，肺組織中Akt 的含量無明顯變化；然而與對照組相比，CLP 組p-Akt的含量明顯升高；與CLP+PBS 組相比，用葛瑞林治療的ALI 小鼠的肺組織中p-Akt 含量顯著降低（均P＜0.05）。

2.4 對膿毒癥致ALI 小鼠存活率的影響

圖4 示，與CLP 組和CLP+PBS 組相比，治療后72h、96h 和120h，葛瑞林干預顯著改善了膿毒癥致ALI 小鼠的存活率（均P＜0.05）。

3 討論

ALI 是由局部或全身炎癥反應引起， 主要是膿毒癥[3]。CLP 是一種廣泛應用于體內模擬膿毒癥的方法。由于盲腸充滿細菌，對其進行穿刺結扎可致細菌性腹膜炎、細菌入血、膿毒癥性休克、多臟器功能不全，最終導致死亡。CLP 被公認為是實驗性誘導膿毒癥或膿毒癥致ALI 的金標準[11]。

膿毒癥時， 機體與細菌之間復雜的相互作用可觸發細胞因子網絡的級聯放大反應等多種炎癥途徑[3]。因此在膿毒癥致ALI 中， 大量釋放的TNF-α、IL-6 和IL-1β 等激發異常的免疫反應，導致肺組織損傷。我們的實驗結果顯示，葛瑞林治療不僅改善了肺組織學，而且降低了肺損傷指數。同時， 葛瑞林治療也能抑制膿毒癥誘導的ALI 小鼠的炎癥反應。與CLP 組和CLP+PBS 組相比，CLP+葛瑞林組的ALI 小鼠的MPO 活性、 炎性細胞計數、 炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和MIP-2 的分泌均降低。這些結果表明，葛瑞林通過抗炎機制對膿毒癥致ALI 具有潛在的治療作用。

已有研究顯示， 編碼上述炎性細胞因子的基因轉錄可由Akt 調控[12，13]，Akt 信號通路在炎癥反應的調節中起著關鍵作用， 而且有研究顯示，Akt通路可在炎癥反應過程中被激活，激活的PI3K 誘導PIP3 和PIP2 的生成， 從而導致Akt 的激活（Akt 第473 位絲氨酸的磷酸化）， 隨后，Akt 通過磷酸化下游分子，如GSK-3 和Bcl-2 家族，促進炎癥過程中多種促炎癥介質，包括細胞因子、趨化因子和黏附分子的表達[14，15]。因此，為進一步了解葛瑞林對膿毒癥誘導的ALI 小鼠炎癥反應抑制機制， 我們接下來檢測了不同實驗組肺組織中Akt的含量及其磷酸化水平。我們觀察到，用葛瑞林治療的ALI 小鼠的肺組織中的Akt 磷酸化受到明顯抑制。結果提示葛瑞林阻斷ALI 小鼠的炎癥反應的作用機制可能與調節Akt 通路的活化有關。

存活率是評價藥物療效的關鍵指標。為了進一步評估葛瑞林對膿毒癥致ALI 小鼠的存活影響，我們對各組小鼠進行了存活率的比較，結果提示葛瑞林干預顯著改善了膿毒癥致ALI 小鼠的存活率。

總之，在膿毒癥誘導的ALI 小鼠中，葛瑞林可以改善肺組織學，延長存活時間，降低肺組織中促炎細胞因子的水平。這些潛在的治療作用可能是與抑制Akt 信號通路相關。因此，葛瑞林可作為膿毒癥致ALI 治療的候選藥物。