急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細(xì)胞及其遷移潛能

白雪峰 何信眾

(桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，浙江 桐鄉(xiāng) 314500)

人類(lèi)上呼吸道反復(fù)暴露于多種吸入的微生物，因此，上呼吸道感染是初級(jí)衛(wèi)生保健急診室就診的最常見(jiàn)原因〔1,2〕。上呼吸道病原體中高感染率，流感流行和抗生素耐藥性增加，都表明需要更有效的疫苗接種策略來(lái)保護(hù)這一門(mén)戶(hù)〔3〕。黏膜抗體在上呼吸道的黏膜防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因?yàn)槠涫歉蓴_感染的初始步驟，可防止病原體的附著〔4～6〕。特異性抗體分泌細(xì)胞(ASCs)的傳播具有組織選擇性，其中歸巢受體(HR)和趨化因子受體起中心作用〔7，8〕。尚不完全了解哪些HR將細(xì)胞引導(dǎo)至呼吸道，并且在該位點(diǎn)引起的反應(yīng)的靶向仍未在人類(lèi)中進(jìn)行充分研究。因此本文對(duì)急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細(xì)胞及其遷移潛能進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月至2018年12月的260例門(mén)診患者，其中急性扁桃體炎130例(扁桃體炎組)，急性鼻竇炎130例(鼻竇炎組)。急性扁桃體炎診斷〔9〕基于典型病史，包括發(fā)燒，喉嚨痛，前頸椎病等。急性鼻竇炎診斷典型病史包括鼻充血，膿性鼻涕，面部疼痛或壓力，嗅覺(jué)受損等，并且上頜灌溉細(xì)菌膿性分泌物≥105cfu/ml，患者細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性，且癥狀持續(xù)時(shí)間少于2 w。選取90例在醫(yī)院體檢的健康志愿者為健康組。3組一般情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。排除標(biāo)準(zhǔn)〔10〕：①肝功能或腎功能異常；②嚴(yán)重高血壓；③器質(zhì)性心臟病；④糖尿病；⑤惡性腫瘤；⑥免疫功能低下；⑦先天性疾病。患者均獲得書(shū)面知情同意書(shū)，研究方案和數(shù)據(jù)管理得到地區(qū)衛(wèi)生服務(wù)人類(lèi)研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 3組一般情況比較

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 第1次就診期間，由耳科醫(yī)生進(jìn)行上頜灌洗(鼻竇炎組)并采集咽拭子(扁桃體炎組)，根據(jù)主治醫(yī)院的微生物實(shí)驗(yàn)室的程序分離病原體。將每種分離物懸浮在0.9%鹽水溶液中，加入濃度為2%的甲醛，將濃度調(diào)節(jié)至108細(xì)菌/ml磷酸鹽緩沖液(PBS)。在急性鼻竇炎或扁桃體炎患者中尋找病原體特異性循環(huán)ASCs。使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)測(cè)定法分析病原體特異性ASCs及其同種型分布，并通過(guò)免疫磁性細(xì)胞分選和ELISPOT組合檢測(cè)整合素α4β7和L-選擇素的表達(dá)。

1.3觀(guān)察指標(biāo) 進(jìn)行總外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)群體、受體陽(yáng)性和陰性亞群中病原體特異性ASC分析和IgA，IgG和IgM的ELISPOT分析。為評(píng)估病原體特異性ASC，致病菌株的懸浮液使用96孔微量滴定板。在IgA、IgG和IgM的ELISPOT分析中使用人IgA，IgM或IgG特異性抗血清(在PBS中稀釋)。洗滌并掩蔽孔后，加入總PBMC群的等分試樣或受體陽(yáng)性和陰性亞群。用堿性磷酸酶耦聯(lián)的抗人IgA，IgG或IgM檢測(cè)細(xì)胞分泌的抗體/免疫球蛋白，接著用熔化的瓊脂糖中的底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)檢測(cè)。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 通過(guò)HE法觀(guān)察急病原體特異性漿細(xì)胞。將樣本置于包埋盒中沖洗30 min后用一定濃度梯度的酒精進(jìn)行脫水處理，然后用石蠟包埋，切成5 μm厚度大小，烘干后進(jìn)行HE染色。使用明視場(chǎng)顯微鏡和掃描共聚焦激光顯微鏡檢查所有樣品并拍照。

1.5細(xì)胞活力測(cè)定 在96孔板中培養(yǎng)病原體特異性漿細(xì)胞，以1/10稀釋度向每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度。根據(jù)的平均光密度(OD)計(jì)算細(xì)胞活力的百分比：細(xì)胞活力的百分比= OD處理組/OD對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6遷移相關(guān)蛋白免疫印跡分析 靜脈抽取血液樣本，離心稀釋?zhuān)瑢㈦x心樣本放置于100 μl緩沖液中，通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定全細(xì)胞提取物的含量。加入10 μg樣品并在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離。轉(zhuǎn)移后硝酸纖維素膜在4℃下用5%牛血清白蛋白封閉過(guò)夜處理，用指示的抗體探測(cè)。使用適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍自噭┩ㄟ^(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光觀(guān)察印跡。

1.7整合素α4β7、皮膚相關(guān)抗原(CLA)及L-選擇素檢測(cè)方法 用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集外周血2 ml，搖勻后置入4℃冰箱內(nèi)保存，24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)整合素α4β7、L-選擇素和CLA。采用直接法檢測(cè)整合素α4β7及L-選擇素。整合素α4β7異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠多克隆抗體和L-選擇素標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體分別購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司、eBioscience公司。流式細(xì)胞儀(美國(guó)庫(kù)爾特公司EPITS′ XL)設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為526 nm，利用EPITS′ XL配套軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1鼻竇炎組和扁桃體炎組病原體分析 鼻竇炎組病原體主要為肺炎桿菌〔60例(46.15%)〕和流感病毒〔60例(46.15%)〕，10例為咽峽炎鏈球菌感染。扁桃體炎組病原體主要為化膿性鏈球菌〔110例(84.62%)〕，20例為β-溶血性鏈球菌感染。鼻竇炎感染有70例(53.85%)體溫超過(guò)38℃，扁桃體炎組有90例(69.23%)體溫超過(guò)38℃。

2.2病原體特異性漿細(xì)胞染色 與健康組相比，鼻竇炎組和扁桃體炎組中病原體特異性漿細(xì)胞含量較高，染色顏色也較深，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 病原體特異性漿細(xì)胞染色(×100)

2.3細(xì)胞活力檢測(cè) 與健康組相比，鼻竇炎組和扁桃體炎組中細(xì)胞活力顯著較高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞數(shù)目、染色強(qiáng)度及CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

與健康組比較：1)P<0.05；下表同

2.4遷移相關(guān)蛋白免疫印跡分析 鼻竇炎組和扁桃體炎組與健康組相比基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 遷移相關(guān)蛋白免疫印跡

表3 遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)量

2.5整合素α4β7、L-選擇素和CLA 與健康組相比，鼻竇炎組和扁桃體炎組整合素α4β7、L-選擇素和CLA表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 整合素α4β7，L-選擇素和CLA在病原體特異性ASCs上表達(dá)

3 討 論

IgG證實(shí)是鼻竇炎和扁桃體炎中最常見(jiàn)的Ig同種型。符合以前對(duì)于上呼吸道疫苗接種的研究：扁桃體霍亂免疫和鼻內(nèi)流感疫苗接種已被證明在循環(huán)和扁桃體和腺樣體中誘導(dǎo)IgG主導(dǎo)的漿母細(xì)胞反應(yīng)〔11〕。IgG同種型在肺炎的漿細(xì)胞反應(yīng)中也占主導(dǎo)地位。據(jù)報(bào)道，在腺樣體中存在具有豐富的聚合IgA，J鏈和多聚免疫球蛋白受體(pIgR)/SC特異性上皮成分的黏膜分泌系統(tǒng)，但在扁桃體中沒(méi)有〔12,13〕。因此，鼻竇炎患者的IgA-ASC反應(yīng)頻率高于扁桃體炎可能反映了該疾病中腺樣體中更明顯的B細(xì)胞引發(fā)〔14,15〕。

在急性鼻竇炎和扁桃體炎研究中，病原體特異性漿母細(xì)胞的整體歸巢概況相似：大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)L-選擇素，并且小于四分之一整合素α4β7或CLA。這種相似性表明參與相同的激活位點(diǎn)。數(shù)據(jù)揭示了在上呼吸道引發(fā)的漿母細(xì)胞的獨(dú)特歸巢特征：該特征不僅與腹瀉(整合素α4β7高，L-選擇素低，CLA可忽略不計(jì))或上尿路感染(α4β7中/高，L-選擇素中/高和CLA低)特征相似，也用于下呼吸道感染(整合素α4β7中，L-選擇素高，CLA低)〔16,17〕。該特征似乎與通過(guò)腸胃外疫苗接種引起的全身性免疫應(yīng)答類(lèi)型(整合素α4β7低，L-選擇素高，CLA 低)最相似〔18〕。

據(jù)報(bào)道，高水平的MMP-2和MMP-9可增加內(nèi)皮細(xì)胞的遷移〔3，19〕。在本研究中，MMP-2和MMP-9表達(dá)升高，從而影響急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細(xì)胞的遷移能力。從中可知，急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細(xì)胞表達(dá)較高，細(xì)胞活力增加，遷移相關(guān)蛋白表達(dá)較高。證明急性細(xì)菌性上呼吸道感染在循環(huán)中誘導(dǎo)病原體特異性漿母細(xì)胞，IgG漿母細(xì)胞是主要的同種型。對(duì)于上呼吸道，顯示出具有高比例的L-選擇素和不足的整合素α4β7和CLA的特征性歸巢譜。

綜上所述，急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細(xì)胞表達(dá)較高，細(xì)胞活力增加，遷移相關(guān)蛋白表達(dá)較高。