miRNA-200a調控淋巴瘤細胞增殖遷移的機制

農衛霞 王奎 張蕾 王新華 龍珍珠瑪

(石河子大學醫學院 1第一附屬醫院血液風濕科，新疆 石河子 832008；2預防醫學系；3第一附屬醫院檢驗科；4石河子市人民醫院病理科)

淋巴瘤是免疫系統的實體瘤。在病理學分類上，霍奇金淋巴瘤約占所有淋巴瘤的10%，其余90%被稱為非霍奇金淋巴瘤〔1〕。淋巴瘤患者的組織學表現和臨床特征具有異質性，其診斷和治療比較困難，因此尋找新的治療靶點用于鑒別診斷、制定治療方案和評估預后等具有重要意義。微小RNAs(miRNAs)是一類高度保守的短鏈非編碼RNA，通過與mRNA末端非翻譯區特異性的結合從而進行轉錄后調控。miRNAs的異常表達對于腫瘤的形成有著重要的作用。miRNA-200a來源于miRNA-200家族中，已有研究表明其參與肝癌、乳腺癌和子宮內膜癌等腫瘤細胞的增殖、遷移和凋亡等過程〔2～4〕。目前已有許多miRNAs與淋巴瘤的發生發展密切相關，但miRNA-200a與淋巴瘤的聯系并不清楚。磷酸酶和張力蛋白同源(PTEN)基因作為第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23.3區，其編碼的蛋白具有脂質磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。當PTEN表達發生變化可改變對細胞生長的負性調控，導致細胞生長異常，導致腫瘤的發生。目前已知多種腫瘤中發現存在PTEN基因的突變，如前列腺、乳腺癌和淋巴瘤等〔5,6〕。本文在彌漫大細胞B淋巴瘤細胞系DOHH-2中干擾miRNA-200a的表達，觀察細胞增殖與遷移能力的改變，并探討其分子機制，為淋巴瘤的臨床治療提高新的靶標。

1 資料與方法

1.1材料 DMME培養基、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度、Lipofectamine 2000測定試劑盒均購自美國賽默飛公司；CCK-8試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司)；雙熒光素酶檢測試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司)；鼠抗人miRNA-200a、PTEN單抗及辣根過氧化物酶(HRP)二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化SP900染色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)；MiniAmp PCR儀(美國ABI公司)；DYCZ-24KF電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2細胞培養 DOHH-2細胞(上海素爾生物科技有限公司)，采用含有10%胎牛血清及1%青霉素的DMEM培養液培養，置于在37℃、95%相對濕度、5%CO2培養箱，隔天更換培養液，細胞融合度約為80%則進行傳代培養。

1.3細胞轉染 將對數期細胞種植于12孔板，每孔細胞密度為1×106個1細胞，分為3組：對照組細胞正常培養，陰性對照組及miRNA-200a轉染組根據Lipofectamine 2000說明書轉染。

1.4qRT-PCR檢測miRNA-200a和PTEN mRNA表達 DOHH-2細胞進行轉染的24 h后，采用qRT-PCR法檢測miRNA-200a和PTEN的相對表達量。根據材料miRNA-200a特異性引物、內參材料U6引物及其他相應的引物組分可匹配成20 μl的聯合反應引物體系(反應混合物10 μl、上下游引物各0.8 μl，DNA(每模板2 μl,ddH2O 6.4 μl)，以95℃ 5 min(1個連續循環)、95℃ 30 s(35個連續循環)、58℃ 30 s(35個連續循環)、72℃ 2 min(35個連續循環)和72℃ 6 min(1個連續循環)的綜合反應量為條件分別進行了PCR的擴增。以β-肌動蛋白(actin)為基礎內參。應用2-△△Ct法則可計算義為miRNA-200a的相對函數表達式向量。每組重復6次。miRNA-200a和PTEN的引物見表1。

1.5免疫印跡試驗檢測miRNA-200a和PTEN蛋白表達 DOHH-2細胞進行轉染的24 h后，總細胞蛋白質使用BCA蛋白質測定法測量。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質樣品并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶在PBST中封閉1 h。在4℃下與miRNA-200a(1∶1 000)及PTEN(1∶500)抗體溫育過夜，將聚偏氟乙烯膜用含TBST的緩沖鹽水洗滌，與HRP綴合的山羊抗兔或馬抗小鼠二抗在室溫下孵育2 h，使用化學發光使蛋白帶可視化，β-actin為內參。每組重復6次。

表1 引物序列

1.6CCK8檢測DOHH-2細胞增殖 將DOHH-2細胞進行轉染的24 h后，每孔中加入10%的CCK8溶液，孵育2 h，酶標儀檢測490 nm細胞處的光密度的數值，計算DOHH-2細胞的存活率。每組重復6次。

1.7劃痕實驗檢測DOHH-2細胞遷移 將DOHH-2細胞進行轉染的24 h后，將各組細胞調整至相同的濃度接種于12孔板，待貼壁細胞出現貼壁懸浮后頭迅速進行清理劃痕，用PBS迅速洗去貼壁懸浮得來的細胞，并重新加入RPMI1640培養基。在顯微鏡下記錄不同時間點下DOHH-2細胞劃痕的寬度，計算DOHH-2細胞遷移速率。每組重復6次。

1.8統計方法 采用Graphpad Prism6進行單因素方差分析、SNQ檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞miRNA-200a、PTEN mRNA及蛋白表達比較 與對照組或陰性對照組比，miRNA-200a轉染組的miRNA-200a水平顯著增高(P<0.05)，PTEN水平顯著降低(P<0.05)，對照組和陰性對照組的miRNA-200a、PTEN mRNA及蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，這表明miRNA-200a干擾模型構建成功，miRNA-200a mRNA負調控PTEN mRNA及蛋白的表達。見表2和圖1、2。

2.2各組細胞的增殖和遷移 與對照組或陰性對照組比，miRNA-200a轉染組的相對細胞活力和細胞遷移速率明顯增高(P<0.05)，這表明miRNA-200a依賴PTEN調控DOHH-2細胞的增殖和遷移。見表2。

表2 各組miRNA-200a、PTEN mRNA和蛋白表達及細胞增殖和遷移比較

與對照組比：1)P<0.05，與陰性對照組比：2)P<0.05

1：對照組；2：陰性對照組；3：miRNA-200a轉染組；圖2同圖1 miRNA-200a及PTEN mRNA表達

圖2 miRNA-200a及PTEN蛋白表達

3 討 論

miRNAs是一類長度為18～22 bp的非編碼RNA，其對于調控靶向mRNAs的基因表達十分重要〔7,8〕。最初在秀麗隱桿線蟲中發現了miRNAs導致轉錄后基因沉默的現象〔9〕。miRNAs參與多種生命過程，包括細胞凋亡、分化和增殖。它們涉及多種疾病，如免疫系統疾病、神經系統疾病和腫瘤〔10〕。以往的證據表明許多miRNAs參與腫瘤發生。盡管miRNA僅占哺乳動物基因組的1%，但超過50%的miRNA基因位于與癌癥中的突變的DNA序列中〔11〕。許多腫瘤的miRNA表達譜發生了特異性的改變，例如，在B細胞慢性淋巴細胞白血病中miR-15和miR-16通常是下調或是被刪除的，在Burkitt淋巴瘤患者中miR-155上調了100倍〔11〕。miRNAs可能作為癌基因和抑癌基因參與對腫瘤的調控〔10〕。

PTEN是最常見的腫瘤抑制因子之一，該基因的缺失與癌癥顯著相關，例如50%～80%的子宮內膜癌患者中該基因發生了突變〔12〕。通過抑制蛋白酶B(AKT)和磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，PTEN調控細胞的增殖、遷移和凋亡，在腫瘤的發生發展中十分重要〔13〕。已有研究報道了淋巴瘤患者中PTEN表達下調。一項研究表明，在11個彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞系中有7個完全喪失了PTEN功能，這表明彌漫性大B細胞淋巴瘤可能與PTEN缺失有關。PTEN表達的缺失也與彌漫性大B細胞淋巴瘤患者較差的生存率有關〔6〕。一些miRNAs，如miR-19a和miR-155等，可以通過調控PTEN進而調控腫瘤的發生〔14〕。

在本研究中，與對照組或陰性對照組比，DOHH-2細胞中miRNA-200a mRNA及蛋白表達的干擾導致PTEN的mRNA及蛋白表達上調，表明miRNA-200a干擾模型構建成功，miRNA-200a mRNA負調控PTEN mRNA及蛋白的表達，CCK8和劃痕實驗檢測顯示，miRNA-200a轉染組的相對細胞活力和細胞遷移速率明顯增高，表明miRNA-200a依賴PTEN調控DOHH-2細胞的增殖和遷移，本研究結果與文獻報道類似〔15,16〕。

綜上所述，miRNA-200a調控DOHH-2細胞增殖與遷移能力，其機制可能與調控PTEN的表達有關。