抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子水平對老年腦外傷患者康復(fù)過程的影響

蔣華 胡顯靜 黃昌堯 王時強(qiáng) 李瑞

(黔西南州人民醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 興義 562400)

腦外傷(TBI)是指由穿透、鈍擊、加/減速力導(dǎo)致的顱腦創(chuàng)傷，可嚴(yán)重影響患者的意識、神智、記憶或?qū)е缕渌窠?jīng)病學(xué)/神經(jīng)心理學(xué)的異常，嚴(yán)重的腦外傷甚至可導(dǎo)致死亡，其致死率和致殘率極高〔1〕。老年TBI患者的發(fā)病率逐年升高，合并患有多種基礎(chǔ)疾病，預(yù)后效果差，采取針對性治療措施具有重要意義〔2〕。

現(xiàn)有研究表明TBI的康復(fù)過程涉及人體內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)的相互作用〔3〕。TBI發(fā)生后，易出現(xiàn)腦組織缺血缺氧，產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，當(dāng)ROS產(chǎn)生量超過機(jī)體承受能力時機(jī)體可產(chǎn)生氧化應(yīng)激，起到保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的作用〔4〕。人體內(nèi)抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽還原酶(GR)，小分子丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)等，這些抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子的含量或活性與TBI的康復(fù)有著密切的聯(lián)系〔5〕。本研究通過揭示抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子與TBI等級之間的關(guān)系，為TBI臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要材料 Trizol試劑、TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國，Life Technologies公司)，qRT-PCR試劑盒(美國，GeneCopoeia公司)，BioRad IQTM5 Multicolor實(shí)時熒光定量系統(tǒng)(美國，BioRad公司)，紫外可見分光光度計(美國，Thermo公司，Nanodrop 2000)，Multiskan MK 3酶標(biāo)儀(美國，Thermo公司)，F(xiàn)S-1型電動勻漿器(江蘇，新瑞儀器)，GSH、GSSG檢測試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，SOD鄰苯三酚自氧化法活性檢測試劑盒、CAT過硼酸鈉作底物滴定法活性檢測試劑盒、MDA硫代巴比妥酸法含量檢測試劑盒(南京，建成生物工程研究所)。

1.2方法 于2010年1月至2015年1月選取經(jīng)黔西南州人民醫(yī)院確診的15例老年創(chuàng)傷型腦損傷患者(TBI組)和15例老年健康志愿者(對照組)，分別檢測血清樣本中抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶SOD、CAT、GPX和GR的活性或表達(dá)，檢測抗氧化應(yīng)激相關(guān)小分子MDA、GSH和GSSG的含量。

另選取35例老年TBI患者，其中男29例，女6例，年齡60～78歲，平均(68.27±5.08)歲。另外選取性別及年齡分布與TBI患者一致的35例老年健康志愿者，參與SOD、CAT和MDA的測定，取平均值，以其平均值作為分界點(diǎn)，分別統(tǒng)計TBI患者在各傷殘等級的人數(shù)分布，分析TBI等級(三級和四級，一級和二級)和SOD、CAT、MDA水平(≥健康志愿者平均值，<健康志愿者平均值)之間的相關(guān)性。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.3RNA提取和純度、濃度測定 RNA提取：分別取TBI組及對照組的靜脈血各約2 ml，4℃放置2 h，轉(zhuǎn)速9 000 r/min離心10 min，收集上層血清。所取得的血清量200～500 μl，分別加入血清體積3倍量的TRIzol裂解液(假設(shè)所加裂解液的體積為V)，室溫下靜置5 min，加入1/3V氯仿，劇烈震蕩15 s，靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層液體到另一EP管中，加入2/3V異丙醇，混勻后，室溫下靜置10 min，離心、棄上清。加入75% 4/3V乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μl無RNase雙蒸水，充分溶解后，取1 μl測定RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-80℃環(huán)境中，備用于qRT-PCR檢測。將分裝出的1 μl總RNA用于濃度測定。

濃度和純度以紫外可見分光光度計(Thermo，Nanodrop2000)測定。先以1 μl的RNAase-free水作空白校對測定。測定波長260及280 nm的光密度(A)，計算其比值。當(dāng)測定值小于3時方可正常進(jìn)行RNA樣本測定。RNA樣本測定前給予速度離心，以使充分混勻，記錄所測濃度值和A260/A280值。當(dāng)A260/A280在1.8～2.0時表示RNA的純度適中，所提取的RNA可用于后續(xù)實(shí)驗，否則應(yīng)予調(diào)整。

1.4qRT-PCR檢測 測定方法：以1.3中提取的血清總RNA為模板，按TaqMan的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板，按GeneCopoeia公司的qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測設(shè)備為BioRad IQTM5 Multicolor實(shí)時熒光定量系統(tǒng)(美國，BioRad)。

引物均由美國Invitrogen公司合成，其中CAT正義鏈：5'-GCCACAGGAAAGTACCCCTC-3'，反義鏈：5'-CGGTGAGTGTCAGGATAGGC-3'，擴(kuò)增長度為281 bp。SOD正義鏈：5'-ACAAAGATGGTGTGGCCGAT-3'，反義鏈：5'-AACGACTTCCAGCGTTTCCT-3'，擴(kuò)增長度為162 bp。GPX正義鏈：5'-AAGGCCGAGTATCCGATTT-3',反義鏈：5'-GCGAGCAGCTTCTTGAGG-3',擴(kuò)增長度為308 bp。GR正義鏈：5'-TTACGCCAAGTTATTTAGGTGACA-3',反義鏈：5'-AAGAGTTACTCAAGAACAAGAA3-3'，擴(kuò)增長度為236 bp。其中β-actin為內(nèi)參，正義鏈：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反義鏈：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'，擴(kuò)增長度為268 bp。2-ΔΔCt用于計算相對表達(dá)量。反應(yīng)體系為20 μl，每組實(shí)驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5硫代巴比妥酸法測定MDA的含量 提取TBI組及對照組的靜脈血血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，用硫代巴比妥酸法測定所有樣本的血清中MDA的含量以532 nm比色測定的OD值與四乙氧基丙烷標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對應(yīng)濃度，再乘以68.89即為血清中MDA的含量。

1.6過硼酸鈉作底物滴定法測定CAT的活性 提取TBI組及對照組的靜脈血血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，用過硼酸鈉作底物滴定法測定所有樣本血清中CAT的活性。取干凈的錐形瓶，按照說明書操作，每只中分別加入50 mmol/L的磷酸緩沖液和100 mmol/L的過硼酸鈉，混勻，置于20°的水浴鍋中加熱10 min，加入待測的血清樣品，達(dá)到所需的反應(yīng)時間時，加入1 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用10 mmol/L的高錳酸鉀液滴定測定CAT的活性。

1.7鄰苯三酚自氧化法測定SOD的活性 提取TBI組及對照組的靜脈血血清，按照說明書進(jìn)行操作，樣品孔和樣品空白對照中分別加入血清樣品，在不含抑制劑的空白對照和試劑空白對照中分別加入雙蒸水。每孔均加入四氮唑(WST)工作液，混勻。樣品空白對照和試劑空白對照中分別加入稀釋緩沖液。樣品孔和不含抑制劑的空白對照中分別加入酶工作液，混勻。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，用酶標(biāo)儀在450 nm處讀數(shù)。

1.85,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)速率比色法測定GSH和GSSG含量 試液配制：按說明書進(jìn)行操作，分別配制GSH標(biāo)準(zhǔn)儲存液(10 mmol/L)，50×GSH還原酶，GSH檢測工作液，總谷胱甘肽(T-GSH)檢測工作液，標(biāo)準(zhǔn)品和NADPH工作液。樣本制備時盡量使用新鮮的血液進(jìn)行測定，樣本先4℃度放置2 h，轉(zhuǎn)速9 000 r/min離心10 min，收集上層血清，加入蛋白沉淀工作液，充分振勻，4℃或冰浴放置，離心，取上清用于T-GSH含量測定。

測定操作：分別設(shè)置空白、標(biāo)準(zhǔn)和測定管，按說明書提供的順序依次加入。按照動力學(xué)測定法，在酶標(biāo)儀上的410 nm處每2 min檢測一次吸光度值，采用空白管調(diào)零，總檢測時長為6 min，檢測其反應(yīng)速率ΔA/min(濃度為橫坐標(biāo)，ΔA410/min為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線)。根據(jù)待測ΔA410/min和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算GSH和T-GSH含量。其中GSSG含量=T-GSH含量-GSH含量。

1.9TBI患者的世界衛(wèi)生組織殘疾評定方案2.0(WHO-DAS Ⅱ)評定 WHO-DASⅡ是世界衛(wèi)生組織制定的用于殘疾等級評級的標(biāo)準(zhǔn)，使用WHO-DAS Ⅱ國際中文版檢查者評定版問卷(http://www.who.int/classifications/icf/more_whodas/en/)，從理解交流、身體移動、生活自理、與人相處、生活活動、社會活動6個方面對TBI患者的整體功能進(jìn)行綜合評估，共36項評估指標(biāo)。其中WHO-DAS Ⅱ總分值<52分為正常，即不存在障礙；52～95屬于殘疾四級，為適應(yīng)行為輕度障礙；96～105分屬于殘疾三級，為適應(yīng)行為中度障礙；106～115分屬于殘疾二級，為適應(yīng)行為重度障礙；≥116分屬于殘疾一級，為適應(yīng)行為極重度障礙〔6〕。按照各項指標(biāo)的嚴(yán)重程度(無，輕度，中度，重度，極重度)統(tǒng)計各項人數(shù)。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1TBI組及對照組血清MDA含量及SOD、CAT、GSH和GSSG活性比較 和對照組相比，TBI組血清SOD、CAT和GSH活性顯著降低，而MDA和GSSG的含量顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 TBI組及對照組血清MDA含量、SOD、CAT、GSH、GSSG活性比較

2.2TBI組及對照組血清SOD、CAT、GPX和GR mRNA表達(dá)比較 和對照組相比，TBI組血清SOD、CAT和GR mRNA表達(dá)水平顯著降低，而GPX mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，見表2。

表2 TBI組及對照組血清SOD、CAT、GPX和GR mRNA表達(dá)比較

2.3WHO-DASⅡ評定結(jié)果 在35例TBI患者中，WHO-DAS Ⅱ評分一級8例，二級10例，三級6例，Ⅲ級11例。

2.4TBI患者的殘疾等級與MDA，SOD和CAT的關(guān)聯(lián)性 35例老年健康志愿者M(jìn)DA的含量為4.84 nmol/g，SOD的活性為62.31 U/mg，CAT的活性為12.07 U/mg。

35例老年TBI患者M(jìn)DA，SOD和CAT資料按健康者的對應(yīng)平均值分層后進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：TBI患者的殘疾嚴(yán)重程度愈高，其MDA的含量愈高，而SOD和CAT的活性則愈低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 TBI患者的殘疾等級與MDA、SOD和CAT的關(guān)聯(lián)性

3 討 論

TBI是所有類型的創(chuàng)傷中危害最大的一種類型，其發(fā)生率高，致死率高，致殘率也高〔7，8〕。通常TBI患者可經(jīng)過搶救而幸存，但TBI常常會對患者產(chǎn)生較嚴(yán)重的生理和心理影響，例如在生理上，TBI可導(dǎo)致患者的運(yùn)動障礙、神經(jīng)傳導(dǎo)障礙、感覺障礙、語言障礙、自主意識障礙等；在精神上，TBI可導(dǎo)致患者產(chǎn)生恐懼感或不安全感等〔9〕。隨著我國人民生活水平高的日益提高，老年人的壽命逐漸增長，同時機(jī)體各項功能減退，老年人的腦部存在不同程度的萎縮，增加顱內(nèi)緩沖空間，臨床陽性癥狀不明顯，容易造成漏診〔10〕。近年來，多項研究報道指出氧化應(yīng)激在TBI康復(fù)中發(fā)揮著極其重要的作用〔11～14〕。但人體本身的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有耗氧量高和脂質(zhì)含量豐富的特點(diǎn)，因此較容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化的現(xiàn)象，最終可導(dǎo)致對神經(jīng)元的損傷，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)對氧化損傷十分敏感，因此此時中樞神經(jīng)系統(tǒng)會調(diào)用其本身的內(nèi)源性抗氧化酶防御系統(tǒng)以維持細(xì)胞的氧化還原平衡〔15，16〕。人體內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)，相互依賴，相互制約，共同維持人體內(nèi)環(huán)境的平衡〔17〕。

人體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)主要有兩大類。一類為抗氧化酶類，包括SOD、CAT、GR、GPX、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、血紅素氧合酶1等〔18,19〕。另一類為非酶性抗氧化劑，包括GSH、硫基蛋白、銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、N-乙酰半胱氨酸、維生素C、脂溶性的抗氧化物質(zhì)MDA、水溶性抗氧化物質(zhì)等〔20,21〕。本研究結(jié)果表明腦損傷導(dǎo)致機(jī)體抗氧損傷相關(guān)的酶和產(chǎn)物SOD、CAT、GSH和GR的表達(dá)和活性均降低，而脂質(zhì)氧化損傷后的產(chǎn)物MDA，GSSG和GPX表達(dá)均增加。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)這35例老年患者均存在不同程度的障礙。且通過與老年健康志愿者的MDA，SOD和CAT含量/活性平均值比較，我們發(fā)現(xiàn)老年TBI患者的殘疾嚴(yán)重程度愈高，其MDA的含量愈高，而SOD和CAT的活性則愈低,即老年TBI患者的殘疾程度與MDA、SOD和CAT有關(guān)。后續(xù)研究擬收集老年TBI患者的臨床病理學(xué)參數(shù)，分析MDA、SOD、CAT這三者與老年TBI患者生存、預(yù)后和其他病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性，進(jìn)一步明確它們之間的關(guān)系，期望進(jìn)一步探究TBI康復(fù)中的抗氧化應(yīng)激機(jī)制，期望為TBI的臨床藥物開發(fā)提供的新的思路。