GNA13在多種惡性腫瘤中的研究進展

朱偉力 馬繼偉， 周赫 鄧暢 奚悅 夏明 趙苗青，★

近年來，隨著分子診斷技術在臨床中的廣泛應用，其對于腫瘤的早期診斷以及預后治療有著極其重要的臨床意義。G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）是己知的體內最大的蛋白質超家族，而G12亞家族中的鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基13（Guanine nucleotide binding protein alpha 13，GNA13）被認為與癌基因轉化和腫瘤細胞生長密切相關。有學者發現GNA13在人類的許多惡性腫瘤中表達上調，特別是在侵襲性強的乳腺癌和前列腺癌中；而且，GNA13的上調會促進這些惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移[1]。因此，本文以GNA13在腫瘤細胞中的信號轉導機制為思路，總結其在惡性腫瘤中的作用機制及生物學特性。

1 G蛋白及G蛋白偶聯受體的結構及其功能

G蛋白是一類信號轉導蛋白，又稱為GTP結合蛋白，種類大約有40余種，可將外界信號傳遞至細胞內，進而激活下游的各種信號通路[1]。GPCRs是一大類膜蛋白受體的簡稱，又稱為七次跨膜受體[2]。GPCRs 被配體激活以后，通過G蛋白將細胞信號傳導至下游效應子，進而調控細胞的生長代謝和改變細胞骨架結構等活動[3]。被激動劑（激素、神經遞質和生長因子等）激活后的GPCRs 可以充當鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factors，GEF），進而催化GDP 交換Gα 亞基上的GTP。與GTP結合后，Gα與Gβγ分離的同時激活下游效應子，包括腺苷酸環化酶、磷脂酶C和Rho 鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factors for Rho，RhoGEFs）等，進而開啟不同的信號轉導通路[3]。Gα（12/13）家族通路通過含有G蛋白信號調節因子同源結構域的Rho-GEFs 將信號傳遞給Rho 蛋白，從而調節細胞生長、基因轉錄和細胞骨架肌動蛋白的重排等[4]（見圖1）。

2 GNA13的發現及功能研究

1991年Strathmann和Simon 在克隆小鼠中發現了G12亞家族中的Gα12和Gα13，它們的分子量約為44kDa。Gα12和Gα13 分別是由鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α 亞基12（Guanine nucleotide binding protein alpha 12，GNA12）和GNA13 編碼[5]。在人類中，GNA12 位于7號染色體上，GNA13 位于17號染色體上。GNA12 與GNA13 幾乎在所有組織中都有表達，但是它們的表達都是十分保守的，并參與多種生理和發育過程[12]。研究表明，血管緊張素II，血栓烷A2，1-磷酸鳥苷-磷酸和溶血磷脂酸等都可以與GNA12/GNA13 耦聯。同時，GNA12和GNA13組成的G12亞家族增強了與細胞分裂、增殖、遷移侵襲和腫瘤發生等許多病理生理活動[6]。

目前已經發現了很多與GNA12/GNA13 直接或間接相互作用的蛋白，其中包括RhoGEFs 蛋白家族所介導的信號轉導通路，其調控著細胞增殖分化及腫瘤性轉化[7]。由于該蛋白家族存在G蛋白信號調節因子結構域，因此GNA12和GNA13 可以通過該結構域與RhoGEFs 結合，將其從細胞質募集到胞膜上，并激活RhoGEFs，從而發揮鳥嘌呤交換因子的功能，以此來促使GTP 與RhoA 結合，進而引起細胞的形態改變以及收縮和遷移[8]。現已從Rho-GEFs 亞家族中鑒定出3種蛋白，包括p115-Rho-GEFs、PDZ-RhoGEFs和白血病相關的RhoGEFs（Leukaemia Associated RhoGEFs，LARG）[9]。研究表明，GNA13（非GNA12）可以直接刺激LARG和p115-RhoGEFs 的GEF 活性[10]。在體外的實驗發現，GNA13 能夠激活p115-RhoGEFs 或非磷酸化的LARG，而GNA12 通常激活酪氨酸磷酸化的LARG，因此，p115-RhoGEFs和LARG是GNA12/GNA13的GTP 酶激活蛋白，且它們是GNA12/GNA13 所特有的，而PDZ-RhoGEFs 不具有此功能[11]。實驗表明，GNA12/GNA13 通過與RhoGEFs的相互作用誘導RhoA 的活性。同時，P115-Rho-GEFs或LARG的RH結構域表現出GNA12和GNA13的特異性GTPase 活化蛋白活性。因此，RH-RhoGEFs 在單個分子的范圍內既起到了GTPase 活化蛋白的作用，又起到了GNA12 或GNA13的效應作用[12]。

Offermanns 等[13]發現GNA12/GNA13的功能十分重要。因為GNA12 敲除的小鼠表現正常，而GNA13 敲除的小鼠在胚胎第9.5 天由于其血管系統發育不正常而死亡。GNA12和GNA13 同時敲除的小鼠也在胚胎第8.5 天死亡。而只攜帶一個完整GNA13等位基因的GNA12 敲除的小鼠也會在子宮中死亡。GNA13 除了在胚胎循環系統中的作用外，其在人體各種病理過程中也成為了關鍵因素，例如，卵巢經歷激素調節的變化，表現為卵巢卵泡生長并伴有卵巢的擴張。GNA13 介導的信號通路還涉及到例如VEGFR-2表達、涉及小GTPase RhoA和轉錄因子NF-κB 的激活[14]。

在分子診斷中也顯示出GNA13的意義，Kim等[15]發現在乳腺癌，GNA12和GNA13 誘導基質金屬蛋白酶（MMP）-2 上調，導致MCF10A 細胞產生侵襲和遷移表型。通過觀察人的乳腺組織樣本，證明了G12蛋白家族和MMP-2 的表達水平與癌癥的診斷密切相關（P＜0.005）。Cheng 等[16]發現，從正常口腔粘膜標本（NOM）到口腔上皮異常增生（OED）到口腔鱗狀細胞癌（OSCC），GNA12 的表達逐步升高，這表明GNA12 的過表達可能是口腔癌發生的早期表現，并且可能在口腔癌的進展中起關鍵作用，而GNA13 或許也有同樣的作用。因此GNA12/GNA13 可能將為某些癌癥提供臨床診斷證據或成為新型腫瘤標志物。

3 GNA13與多種惡性腫瘤的關系

在發現G12家族后不久，GNA12和GNA13都被證明具有誘導成纖維細胞致癌轉化的能力[24]。因此，GNA13與各種惡性腫瘤之間的生物學關系成為了研究者關注的焦點問題。

3.1 GNA13與乳腺癌

Rasheed 等[17]發現在乳腺癌中，GNA13 能與GPCRs 相互作用促進下游信號分子的傳導，從而造成惡性腫瘤的侵襲和遷移。乳腺癌細胞是依賴于GNA13的表達來實現細胞侵襲，GNA13 參與導致乳腺癌發展的轉錄后基因表達機制是通過微小RNA（microRNA，miRNA）來調控的。miRNA 與目的基因的mRNA 緊密聯系，同時抑制其蛋白的表達，miRNA 與編碼序列或目標基因3′-UTR 的結合可致使mRNA 降解過程或蛋白翻譯過程受到影響，最終抑制靶基因產生蛋白質。與前列腺癌細胞不同，乳腺癌細胞中GNA13的表達主要是通過miR-31 而不是通過miR-182和miR-200a 調控的。同時研究證明miR-31 直接與GNA13的mRNA 結合，并且這種結合會影響GNA13 表達和乳腺癌細胞侵襲。Vrba 等[18]發現，miRNA 表達失調能夠顯著表現出來，其中miRNA 可以充當“致癌miR”或“腫瘤抑制miR”，而這一過程其可以通過靶細胞中潛在的癌基因來實現。miR-31 在腫瘤進展中丟失，并促進乳腺癌和其他癌癥的遷移。因此，確定乳腺癌和其他癌癥中GNA13 調控的特定機制可能會導致針對這些癌癥的基于miRNA 的治療策略的發展。此外，miR-31 的缺失和GNA13的獲得可能是評估乳腺癌和其他癌癥的可行生物標志物。

3.2 GNA13與前列腺癌

Lim 等[19]發現單獨阻斷GNA13 會顯著影響前列腺癌的癌細胞侵襲和轉移。GNA13 通過Rho GTPases 發揮作用，以驅動NF-κB 轉錄來誘導前列腺癌細胞中CXCL5 的表達。在轉移性前列腺癌細胞中，發現患者體內的CXCL5 水平顯著提高，并通過促進血管生成來誘導腫瘤細胞的增殖、遷移和轉移，這是由于GNA13 通過誘導內皮細胞中的VEGFR-2 或誘導細胞促進血管生成的CXCL1、CXCL2和CXCL4 來誘導腫瘤細胞血管的生成，進而影響腫瘤的生長。當列腺癌細胞中GNA13 表達沉默后，促血管生成基因會大量丟失。Rasheed等[17]發現在前列腺癌中，僅野生型GNA13的丟失就可能顯著降低前列腺癌細胞在體外的浸潤和轉移的機會。使用特定的miRNA 抑制劑抑制LnCAP 細胞中的miR-182和miR-141/200a 可提高GNA13的表達并增強對這些細胞的侵襲。這些數據證明GNA13是前列腺癌細胞侵襲的重要介質。由于GNA13 可以充當前列腺癌細胞以及多種腫瘤細胞的致癌GPCRs 信號的共同介體，因此確定其失調機制可能會使新型miRNA 成為未來抑制癌癥侵襲和轉移的方法。因此，建立以GNA13 為目標的檢測方法對于早期診斷前列腺癌具有重要作用，同時以miR-182 等分子為靶標進行靶向治療的意義重大。

3.3 GNA13與肝癌

Xu 等[20]通過探討246例肝癌患者GNA13 表達與臨床病理特征的關系發現GNA13在肝癌組織中的顯著上調與多種臨床病理學參數相關，包括腫瘤多重性（P=0.004）、TNM 分期（P=0.002）和BCLC 分期（P=0.010），GNA13 表達是整體生存（P=0.014）和無瘤生存（P=0.005）的獨立預后因素。為了確定GNA13 對肝癌細胞增殖和侵襲的影響，其建立了穩定表達GNA13的肝癌細胞HepG2和SMMC-7721。與對照組相比，GNA13的過表達在體外促進HepG2和SMMC-7721 細胞的細胞增殖；侵襲試驗證明，在HepG2和SMMC-7721 細胞中過表達GNA13 會使細胞侵襲能力顯著提高。通過免疫組化對肝癌細胞樣本評估GNA13 蛋白的表達情況發現GNA13 蛋白主要在肝癌的細胞質中檢測到，正常肝組織主要表現為GNA13 陰性表達。因此，GNA13是肝癌致瘤過程中較為關鍵的一個影響因素，可以作為肝癌患者的預后生物標志物，特別是在行根治性肝切除術后的患者中，其中GNA13的高表達提示肝癌患者的預后較差。

3.4 GNA13與胃癌

Zhang 等[21]發現GNA13的上調可以促進胃癌（Gastric cancer，GC）細胞的致瘤性和增殖。在GC組織和細胞中，GNA13 表達水平顯著提高，并且與侵襲性的GC 進展程度和患者生存不良密切相關。當GNA13的表達水平增高時，其通過促進小鼠的細胞增殖速率、集落形成和腫瘤形成，從而增加了GC 細胞在體外和體內的增殖和致瘤性。相比之下，敲除GNA13基因能夠有效地抑制GC 細胞在體外和體內的增殖和致瘤性。GNA13在GC中發揮作用的分子機制包括通過上調c-Myc，激活AKT 信號通路和ERK 信號通路，同時抑制FOXO1的活性。通過上調細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）來促使G1/ S 細胞周期發生轉變，進而調節細胞周期蛋白D1和CDK 抑制劑（p21Cip1和p27Kip1）的下調。因此，以p21Cip1和p27Kip1 等作為靶標可以對GC 的早期診斷或預后進展的監測起到重要指導作用。

3.5 GNA13與頭頸部鱗癌

Rasheed 等[22]發現在頭頸部鱗癌（Head and neck squamous cell carcinoma，NHSCC）中，GNA13是耐藥性和預后不良的生物標志物，而且GNA13在體外和體內都可調節HNSCC 細胞的發生和呈現腫瘤起始樣（Tumor initiating cells，TICs）表型，其通過NFκB和MAPK 信號通路促進TICs 表型和耐藥性。為了確定表達高水平GNA13的腫瘤的侵襲性是否與較差的治療反應有關，用順鉑，5-氟尿嘧啶（5-FU），紫杉醇，阿霉素或γ 電離輻射（IR）處理細胞，與低表達GNA13的細胞相比，高表達GNA13的細胞系對所有治療方式均具有抗性。低表達GNA13的細胞中能夠使得其對一些藥物（例如鉑類藥物）的敏感性升高2～3倍。高表達GNA13的細胞更早地開始促進腫瘤發生和發展，其只需5000個細胞即可導致裸鼠成瘤。使用小分子抑制劑阻斷GNA13的表達或某些下游通路的表達，可以消除GNA13 誘導的TICs 表型，使癌細胞能接受標準的細胞毒性治療。這些數據表明，GNA13 對于HNSCC 細胞中與TICs 表型相關的所有性質都是必要的。因此，GNA13 作為NHSCC 進展的潛在預后生物標志物，干擾GNA13 誘導的信號傳導就為阻斷TICs和降低HNSCC 耐藥性提供了新的方法，因此阻斷GNA 13 誘導的MAPK/AP-1或NFκB 信號通路，確實是一種針對TICs 誘導的腫瘤生長和治療NHSCC 耐藥性的策略。

3.6 GNA13與淋巴瘤

生發中心B細胞（Germinal center B cell，GCB）來源的彌漫性大B細胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，GCB-DLBCL）是一種常見的惡性腫瘤。Muppidi 等[23]發現GNA12和GNA13在GCB 細胞中均被上調，其中以GNA13 上調更為顯著。研究顯示在GCB-DLBCL 活檢樣本中頻繁出現GNA13 編碼突變，GNA13 缺陷足以在腸系膜淋巴結（mLNs）中賦予GCB 細胞生長優勢，而在淋巴集結（PPs）中則具有較小的優勢。GNA13 突變和BCL2 重排以及可能激活的突變經常在GCBDLBCL 中同時發生。合并GNA13 缺陷和BCL2過表達的小鼠中的GCB 細胞顯示出更高的離體存活率。人類P2RY8 導致了對小鼠PPs和mLNs 中GCB 細胞生長的抑制作用，類似于S1PR2 過表達的作用，而這種抑制作用要求P2RY8 與GNA13 相偶聯，因為如果細胞缺少GNA13 則無法看到此生理現象。通過以上實驗發現人體內的P2RY8 可以通過GNA13 依賴性途徑來抑制GCB 細胞的生長并促進B 細胞在GC 位置定位。Morin 等發現健康人體內的GCB 由于受一些生理因素的影響，只能存在于生發中心內部，無法進入到循環系統之中，而缺乏GNA13 時，會使得GCB 進入血液循環。經測序研究發現，GNA13和S1PR2 突變則主要見于GCB來源的GCB-DLBCL。總之，GCB中的GNA13的丟失會造成抗細胞凋亡，同時體細胞會受到其誘導影響，發生高頻突變從而產生淋巴瘤[24-25]。因此，通過檢測P2RY8 的變化水平可以對GCB-DLBCL 的發生起到一定的診斷價值。

3.7 GNA13與肺癌

Grzelinski 等[26]發現在小細胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）細胞中，各種自分泌刺激導致GNA12/GNA13的激活。在體外實驗中，GNA12/GNA13 雙重敲除完全消除了小鼠的H69 致瘤性，調節SCLC 細胞增殖的GPCRs 與GNA12/GNA13偶聯，導致Gq/11 磷脂酶C-Ras-細胞外信號調節激酶1/2和GNA12/GNA13-Rho 信號傳導途徑的各自激活。在其他腫瘤中，GNA12/GNA13 激活可促進侵襲性而不影響細胞增殖，而GNA13的高表達在SCLC 中發揮增殖作用。GNA13的下調會明顯抑制體內外的增殖，體內數據還顯示了GNA12和GNA13 耗竭的累加效應，兩種蛋白質的雙重靶向作用能導致腫瘤生長的完全消除，這一開創性發現進一步支持了完整的GNA12/GNA13 信號傳導是SCLC 中腫瘤生長的先決條件的概念。

3.8 GNA13與胰腺癌

Gardner 等[27]近期的研究表明，腫瘤微環境在胰腺癌等一些疾病的進展中的發揮著重要的作用，例如GNA13在溶血磷脂酸刺激引起的胰腺癌細胞侵襲性遷移中就產生了重要影響，從而影響著胰腺癌疾病的進展。研究證明LPA 特異性刺激胰腺癌細胞的遷移但不刺激其增殖，LPA 刺激的胰腺癌細胞的侵襲性遷移受到競爭抑制性基因GNA13 表達的抑制，并且shRNA 介導的GNA13沉默也證明了LPA 刺激的胰腺癌細胞遷移的類似抑制作用。GNA13是參與LPA 介導的胰腺癌遷移的α 亞基，即敲除GNA13 會導致細胞遷移受到抑制，這為胰腺癌的早期診斷提供了新的思路。

4 展望

GNA13在人體中的作用機制眾多且獨特，已被證明是癌細胞增殖、侵襲、遷移和轉移的重要調節劑[14，28]。雖然GNA13的高表達與常見腫瘤進展密切相關，并且GNA13所參與最重要的信號通路之一就是RhoGEFs家族所介導的，但仍需進一步研究以充分闡明GNA13 參與腫瘤轉移和進展的確切機制。相信通過深入研究GNA13 對細胞的增殖分裂、細胞骨架的重排、細胞的遷移與侵襲等生理病理活動產生的影響，闡明其發揮作用的分子機制，未來有望使其成為一個新的治療靶點。