利用熒光PCR-毛細管電泳法評價微衛星不穩定性檢測國家參考品

張文新 黃傳峰 孫楠 高飛 于婷 孫晶 曲守方 黃杰

微衛星（microsatellite，MS）是細胞基因組中以少數幾個核苷酸（多為1～6個）為單位短串聯重復的DNA 序列。微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）是DNA復制時DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）功能缺陷，使微衛星重復序列的錯誤未得到糾正而引起微衛星序列長度發生變化的現象[1]。微衛星不穩定性可以分為3類：微衛星高度不穩定（microsatellite instability-high，MSI-H）、微衛星低度不穩定（microsatellite instability-low，MSI-L）及微衛星穩定（microsatellite stability，MSS）[2]。微衛星不穩定與多種腫瘤的發生、發展密切相關，常見于胃癌、結直腸癌、子宮內膜癌等腫瘤[3-5]。研究報道MSI-H型胃癌擁有獨特的分子基因表型以及臨床病理特征，比MSI-L 以及MSS型的預后好[6]。因此分析腫瘤組織的微衛星不穩定狀態，可以指導腫瘤個體化治療，具有重要臨床意義。

目前臨床上主要采用兩種方法檢測MSI和MMR，多重熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）毛細管電泳法直接檢測MSI，或免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）檢測MMR 蛋白的表達，主要包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 等MMR 蛋白[7-8]。隨著檢測技術發展，高通量測序（next generation sequencing，NGS）技術也應用于腫瘤組織的MSI檢測[9]。目前國內已有公司申請MSI檢測試劑盒（熒光PCR-毛細管電泳法）的注冊。亟需建立統一的國家參考品，用于評估MSI檢測試劑盒的性能。本研究利用熒光PCR-毛細管電泳法檢測微衛星不穩定性檢測國家參考品，驗證微衛星不穩定性檢測國家參考品用于相關試劑盒性能評價及臨床實驗室質量評價的適用性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

微衛星不穩定性（MSI）檢測國家參考品，批號：360028-201901，中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑

微衛星不穩定性（MSI）檢測試劑盒（熒光PCR-毛細管電泳法），上海普洛麥格生物產品有限公司提供。結直腸癌微衛星不穩定狀態檢測試劑盒（熒光PCR-毛細管電泳法），北京閱微基因技術有限公司提供。微衛星不穩定性（MSI）檢測試劑盒（熒光PCR 毛細管電泳法），廣州達瑞生物技術股份有限公司提供。對試劑盒廠家進行隨機編號，分別為公司A，公司B，公司C。

1.3 儀器

3500 Dx基因分析儀和Veriti?Dx 96-well PCR儀，上海普洛麥格生物產品有限公司提供。3500xL Dx基因分析儀和Veriti?Dx 96-well PCR 儀，北京閱微基因技術有限公司提供。3500 Dx基因分析儀和ABI PCR 2720 儀，廣州達瑞生物技術股份有限公司提供。

1.4 方法

各實驗室按照據各自的方法以及試劑盒說明書進行操作。

1.4.1 PCR擴增

將PCR反應液、酶混合液、引物混合液、無核酸酶水置于室溫解凍至完全溶解。配制除模板以外的反應體系，各組分加入后，渦旋振蕩后，分裝到0.2 mL PCR 管中。依次向已分裝擴增體系的各管中加入1 μL 或者0.5 μL 待檢樣本、MSI 陽性對照、陰性對照（無核酸酶水）。將各反應管放置于PCR 儀的反應槽內，運行PCR 程序。

1.4.2 基因分析儀檢測擴增片段

PCR反應結束之后，制備毛細管電泳檢測樣品。以基因分析儀進行毛細管電泳檢測。使用POP7 膠。選擇“Fragment”電泳方法，參考基因分析儀的使用說明書。檢測數據使用GeneMapper?分析軟件進行數據分析。

1.4.3 結果判定

統計試劑盒微衛星檢測位點，對樣本的微衛星不穩定性狀態進行判定：≥2個微衛星位點不穩定，判斷為MSI-H；1個微衛星位點不穩定，判斷為MSI-L；沒有微衛星位點不穩定，則判斷為MSS。

2 結果

2.1 陽性參考品結果

對國家參考品中的16 對陽性參考品共32例樣本進行檢測，3家試劑盒的結果顯示均為微衛星高度不穩定。以國家陽性參考品MSI-3及其對應的配對參考品MSI-3-對照的檢測結果為例，A公司選擇的8個位點均為微衛星不穩定位點，B公司選擇的6個位點均為微衛星不穩定位點，C公司選擇的6個位點也均為微衛星不穩定位點，均檢出相應的微衛星不穩定性狀態。見圖1。

2.2 陰性參考品結果

對國家參考品中的3 對陰性參考品共6例樣本進行檢測，3家試劑盒的結果顯示均為微衛星穩定（MSS）。以國家陰性參考品MSI-19及其對應的配對參考品MSI-19-對照的檢測結果為例，A公司選擇的8個位點中都沒有微衛星不穩定位點，B公司選擇的6個位點中都沒有微衛星不穩定位點，C公司選擇的6個位點中也都沒有微衛星不穩定位點，均檢出相應的微衛星不穩定性狀態。見圖2。

2.3 檢測限參考品結果

對國家參考品中的6 組檢測限參考品共24例樣本進行檢測，3家試劑盒的結果顯示，對20%和10%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品均能正確檢出相應的微衛星不穩定性狀態，而有1家試劑盒對5%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品未能正確檢出相應的微衛星不穩定性狀態。

以國家檢測限參考品MSI-LOD3-20%、MSILOD3-10%、MSI-LOD3-5%及其對應的配對參考品MSI-LOD3-對照的檢測結果為例，A公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的8個位點都為微衛星不穩定位點，B公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的6個位點中分別有6個和3個微衛星不穩定位點，C公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的6個位點中分別有6個和5個微衛星不穩定位點，都檢出相應的微衛星不穩定性狀態。同時A公司MSI-LOD3-5%的8個位點中有7個微衛星不穩定位點，C公司MSI-LOD3-5%的6個位點中有3個微衛星不穩定位點；但B公司MSI-LOD3-5%的6個位點中僅有1個位點為微衛星不穩定位點，未檢出相應的微衛星不穩定性狀態。見圖3。

3 討論

MSI是一種遺傳性改變，與腫瘤的發生密切相關。MSI檢測已被美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結直腸癌臨床實踐指南及中國臨床腫瘤學會（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）結直腸癌診療指南推薦用于所有結直腸癌患者[10-11]。2016年，歐洲臨床腫瘤協會（European Society for Medical Oncology，ESMO）轉移性結直腸癌共識提出，MSI檢測對轉移性結直腸癌患者免疫檢查點抑制劑治療具有重要的預測價值。2017年美國食品藥品管理局（FDA）批準了默沙東公司的帕博利珠單抗注射液（Keytruda），用于治療攜帶MMR功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）和微衛星高度不穩定性（MSI-H）的晚期（轉移性）實體瘤患者。MSI 作為晚期（轉移性）實體瘤特別是結直腸癌患者免疫治療療效的預測生物標志物，其檢測具有重要的臨床意義。

MSI檢測的常用方法是多重熒光PCR 毛細管電泳法，它的原理是選擇美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）推薦的微衛星（MS）位點[12-13]，進行PCR擴增及毛細管電泳，比較腫瘤組織與正常對照組織的結果，確定MSI 狀態。為了標準化MSI 的檢測，1998年NCI 推薦Bethesda 指南，推薦2個單核苷酸重復位點BAT-25和BAT-26和3個雙核苷酸重復位點D2S123、D5S346和D17S250。2002年NCI 進行修訂，推薦5個單核苷酸重復位點BAT-25、BAT-26、NR21、NR24和NR27。Bacher 等人提出Promega分析系統，以Mono-27 取代NR27，并增加Penta C和Penta D 用于識別樣本，進一步提高了MSI檢測的敏感性。我國CSCO 結直腸癌診療指南（2018年版）建議采用NCI推薦的BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346和D17S250 位點進行MSI檢測。

目前國家藥品監督管理局尚未批準微衛星不穩定性檢測試劑盒（熒光PCR-毛細管電泳法）。至今MSI檢測技術仍沒有較為統一的標準，腫瘤MSI檢測位點不僅僅包括以上推薦位點。為了提高MSI檢測的敏感性和特異性，不同廠家的試劑盒開發并選擇了不同的檢測位點。為了更好評價上市前的微衛星不穩定性檢測試劑盒（熒光PCR-毛細管電泳法）性能，建立標準化的統一的國家參考品是非常有必要的。本院建立的微衛星不穩定性檢測國家參考品，來源于FFPE 腫瘤組織或者細胞系以及相應的配對樣本，包括了微衛星高度不穩定、微衛星低度不穩定及微衛星穩定三種狀態，其中微衛星高度不穩定參考品涵蓋了不同的微衛星不穩定位點，能夠有效的評價試劑盒的性能。為了評價試劑盒的檢測敏感性，還根據目前臨床實際應用的檢測水平，設置不同腫瘤DNA 含量的樣本，包括20%、10%、5%三種梯度。

3家不同公司的微衛星不穩定性檢測試劑盒（熒光PCR-毛細管電泳法）對國家參考品62例樣本的結果顯示，陽性參考品的結果均為微衛星高度不穩定，陰性參考品的結果均為微衛星穩定，20%和10%腫瘤DNA 含量檢測限參考品的結果均符合國家參考品的標示結果，而有1家試劑盒對5%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品未檢出相應的MSI 狀態。國家陽性參考品和陰性參考品的檢測結果表明雖然3家公司所選擇的微衛星不穩定性位點有所差異，但是對同一份樣本的微衛星不穩定狀態的結果判定是一致的，均檢出相應的微衛星不穩定性狀態，結果準確。從國家檢測限參考品的檢測結果，發現有的試劑盒對于5%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品不能檢測出相應的微衛星不穩定性狀態。在臨床實際檢測中MSI檢測限一般規定為20%。如果提高試劑盒檢測的敏感性，可能會降低檢測的特異性。根據臨床實際應用，微衛星不穩定性（MSI）檢測國家參考品要求試劑盒對20%和10%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品應檢出相應的微衛星不穩定性狀態；對5%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品可檢出或未檢出相應的微衛星不穩定性狀態。3家公司的微衛星不穩定性檢測試劑盒（熒光PCR-毛細管電泳法）的檢測結果顯示均符合國家參考品的陽性參考品符合率、陰性參考品符合率和檢測限的要求。本實驗室建立的國家參考品，可滿足微衛星不穩定性檢測的要求，適用于熒光PCR-毛細管電泳法試劑盒的性能評價及臨床實驗室的質量評價。