LA16c-313D11.11與miR-205-5p在子宮內膜癌中的表達及意義

韓雪松 丁雪 趙鵬 于輝 辛衛娟★

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，是女性生殖系統常見的腫瘤，隨著女性生活飲食行為習慣的改變，每年的新發病例呈迅猛上升趨勢，在我國已成為僅次于宮頸癌的導致死亡的常見婦科惡性腫瘤[1]。子宮內膜癌的發病原因迄今尚不明確，許多研究證明其涉及除雌孕激素外的許多其他分子通路及機制[2]。近年來大量國內外研究指出子宮內膜癌的發生和發展與非編碼RNA 密切相關[3-5]。研究表明MicroRNA（miRNA）是mRNA 編碼蛋白質的調節因子，對基因表達、細胞分化、凋亡乃至個體發育產生重要影響，其中miR-205-5p 在子宮內膜癌的發生發展中發揮了重要的調控作用，有文獻報道LncRNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）對miRNA有內源競爭抑制作用[6]。本實驗前期研究在含有miR-205-5p 結合位點的LncRNA 中篩選出在子宮內膜癌組織中表達下調的LncRNA-LA16C-313D11.11，并證實其與miR-205-5P 具有競爭抑制作用[7]。但其在子宮內膜癌中的具體作用尚未可知，本研究旨在明確LA16c-313D11.11和miR-205-5p 在子宮內膜癌中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月至2016年2月在復旦大學附屬婦產科醫院進行手術的子宮內膜癌手術標本60例。患者年齡26～76歲，中位年齡55歲。收集同期子宮內膜非典型增生組織20例（患者年齡37～53歲，中位年齡47歲）和正常子宮內膜組織20例（患者年齡49～61歲，中位年齡49歲）作為對照組，正常子宮內膜組織來源于因子宮良性疾病（如子宮脫垂或子宮肌瘤等）行子宮切除術后證實子宮內膜組織正常者。3組年齡有可比性。納入標準：患者術前均未行化療、放療或激素治療且均簽署知情同意書。排除標準：患者術前曾接受激素或放化療治療且未簽署知情同意書者。

1.2 方法

實時熒光定量qRT-PCR 檢測LA16c-313D11.11和miR-205-5p 表達情況按照Trizol（Invitrogen，USA）試劑盒說明書進行細胞總RNA 提取，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。反轉錄使用Prime ScriptTM RT試劑盒（Takara，Japan），按說明書操作。采用Primer5.0軟件設計引物。LA16c-313D11.11 引物：上游5′-TGAAGGA GGTTATTGACGCA；下 游：5′-GAGGGGAAACAGTCCAGAGT。miR-205-5p 引物：上游：5′-TCCACCGGAGTCTGTCTCAT；下游：5′-GCTGTCAACGATACGCTACG。GAPDH 引物：上游：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3；下游：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。采用SYBR Premix ExTaq TM試劑盒（Takara，Japan）和Rotor-Gene3000 系統進行實時熒光定量PCR反應及測定。每個反應設3個復孔。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理，計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗，計量資料用（）表示，兩組間用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析方差不齊者采用非參數檢驗，相關性分析用等級資料Spearman 秩相關，以r=0 作為判斷相關性的標準。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組病理檢查結果

LA16c-313D11.11和miR-205-5p 在不同子宮內膜組織中的表達情況。見圖1。

LA16c-313D11.11 在正常組織、EAH 組織及子宮內膜癌組織中的表達結果為EC組最低，其次為EAH 組，最高是正常組，3組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。miR-205-5p 的表達在正常組織、EAH 組織及子宮內膜癌組織中表達結果為EC組最高，其次是EAH 組，最低是正常組，3組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.2 LA16c-313D11.11和miR-205-5p 的表達與子宮內膜癌臨床病理參數的關系

以中位值作為截斷，將表達量大于等于中位值的LA16c-313D11.11 定義為高表達組，表達量小于中位值定義為低表達組。發現LA16c-313D11.11 低表達與FIGO 晚期及淋巴結轉移有顯著相關（P＜0.05）。結果表明，低表達LA16c-313D11.11 與更具侵襲性的子宮內膜癌表型相關，miR-205-5p 的表達也與FIGO 分期及淋巴轉移相關（P＜0.05）。見表1。

2.3 LA16c-313D11.11與miR-205-5p表達的相關性

在正常子宮內膜組織和EAH 中LA16c-313D11.11和miR-205-5p 的表達，差異無統計學意義（P＞0.05）。在EC組中Spearman 相關分析呈現負性相關（P<0.05，rs＝-0.305）。見表2。

表1 LA16c-313D11.11/miR-205-5p 表達與腫瘤臨床病理指標的關系[n（%）]Table1 Association of LA16c-313D11.11 and miR205-5p expression with the clinicopathological characteristics of patients with EC[n（%）]

3 討論

miRNA是內源性的大小在20～25 nt 的一類非編碼RNA，在細胞核內轉錄成70～100 nt 的雙鏈發夾狀前體RNA 并經過Dicer 酶和Drosha 酶的分步切割，進入RISC 復合體中，通過與靶mRNA 的3′端非編碼區（3′-UTR）不完全配對結合，在轉錄后水平抑制靶mRNA 表達或介導靶mRNA 降解。miRNA 最早于1993年在線蟲身上發現[8]，后續研究闡明其參與生命過程中一系列的重要進程，包括發育、造血、器官形成、凋亡、細胞增殖，甚至腫瘤發生[9-11]。Daikoku 等[10]在小鼠子宮內存在于所有的多細胞生物中，同時具有一定的保守性，提示其在多種生物反應過程中膜癌標本中發現miR-199a、miR-101a下調。Todd 等[12]在對正常子宮內膜、不典型增生內膜及子宮內膜癌的研究中，發現了13個差異表達顯著的miRNA，其中下調的miRNA 5個（1et-7i，miR-221，miR-193，miR-152，miR-30c），上調的miRNA 8個（miR-185，miR-106a，miR-181a，

表2 LA16c-313D11.11 與miR-205-5p 在不同子宮內膜組織中表達的相關性Table2 correlation between LA16c-313D11.11 and miR-205-5p expression in different endometrial tissues

miR-210，miR-423，miR-103，miR-107，let-7c）。Loffe YJ 等[13]研究發現在子宮內膜癌細胞株AN3CA和KLE 中miR-19b、miR-20a、miR-21、miR-26a 高表達。Lee H 等[14]在對正常子宮內膜、異常增生子宮內膜及子宮內膜癌組織的研究中發現miR-182、miR-183、miR-200a、miR-200c和miR-205 在子宮內膜癌中高表達。Karaayvaz M 等[15]對正常子宮內膜組織和子宮內膜癌組織中的miR-200c和miR-205-5p 的表達水平進行檢測，結果發現miR-205-5p 不僅可以作為子宮內膜癌診斷的一個有效標志物，而且能預測子宮內膜癌患者的臨床預后。

LncRNA是一類長度介于200 nt～100 kb 之間的非編碼RNA，位于細胞核和細胞質中，在真核細胞中普遍被轉錄。越來越多的證據表明，LncRNA與癌癥的發生存在密切的關系[16]。LncRNA 差異表達于正常組織與其相應不典型增生的組織及腫瘤中，而且特異性LncRNA 可作為腫瘤的預測因子[17]。Gibb 等[18]從人類正常組織到人類癌組織描寫LncRNA 轉錄譜，在癌癥中存在異常的LncRNA表達譜。應激介導長鏈非編碼轉錄體5（long stressinduced non-coding transcript-5，LSINCT5）是一個在細胞核集中分布，大小為2.6 kb 的多聚腺苷酸，相對于正常的組織，LSINCT5 在乳腺癌和卵巢癌細胞系及腫瘤組織中存在過量表達，敲除LSINCT5 能明顯抑制癌細胞增殖并伴隨多種基因的表達下調，推測LSINCT5 可能是通過調節下游的靶基因，促進癌細胞增殖，發揮致癌作用[19]。Gloss 等[20]研究發現了一個潛在的卵巢癌的表觀遺傳標志物LOC134466，研究顯示該LncRNA 在II型漿液性卵巢癌CpG 島存在高達81%甲基化（81/100），而其它不同類型卵巢癌僅為7.7%（1/13），因此認為該標志物對II型漿液性卵巢癌診斷具有潛在價值。LncRNA-MALAT1通過調節基因表達影響宮頸癌細胞生長和細胞轉移[21]。Akrami 等[22]研究發現在漿液性卵巢腺癌中位于1號染色體上的LncRNA-OVAL 轉錄激活，同樣的現象發生在包括子宮內膜癌在內的其他16種癌癥中。這說明體細胞LncRNA 可以特別針對人類基因組擴增，發揮作用參與腫瘤的發生或發展。

綜上所述，本研究闡明了LA16c-313D11.11 對子宮內膜癌增殖侵襲的影響，以及在子宮內膜癌中LA16c-313D11.11 可能通過內源競爭抑制miR-205-5p 發揮作用，這將為子宮內膜癌的治療提供更有效的思路。后續研究我們將進一步明確其作用機制，從而對子宮內膜癌的診斷和治療提供新的依據。