miR-93-5p對心臟成纖維細胞纖維化的影響

張偉峰 雷素揚 趙俊濤

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種危害人類健康的重要心血管疾病，被稱為發達國家的“頭號殺手”[1]。隨著發展中國家的經濟發展，這種疾病也呈現逐年升高的趨勢。盡管近年來在治療方面取得了進展，但心肌梗死患者隨后發生缺血和死亡的風險仍在增加。因此，開發一種新的高效治療方案具有重要意義。miRNA，一種長度僅在18～22個核苷酸的內源性，高度保守的微小分子，其通過沉默靶基因的轉錄和翻譯過程在人類多種疾病中發揮調控作用[2-3]。且miRNA 也參與了機體多個器官如心臟、肺臟、腎臟、肝臟、皮膚的纖維化過程[4]。miR-93-5p是近2年在心肌梗死中新發現的失調miRNA 之一[5]，其在心肌梗死中的功能及機制尚未十分清楚。弗林蛋白酶（Furin）是一種高度特異性的絲氨酸內切蛋白酶，歸屬于前蛋白轉化酶（proprotein convertases，PC）家族，其在心臟的發育、生長及結構重塑中具有重要作用[6-7]。我們推測miR-93-5p 與Furin 在心肌梗死過程中的成纖維細胞纖維化中具有聯系。本研究旨在探討miR-93-5p 調控心臟成纖維細胞纖維化的功能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

心肌梗死模型小鼠購自上海百致生物醫藥科技有限公司；杜氏培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購自Gibco公司；pcDNA3.1-EGFP 載體購自上海振譽生物科技有限公司；pmir-GLO 載體購自上海鈺博生物科技有限公司；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈免疫反應（Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain immune reaction，qRT-PCR）試劑盒和反轉錄試劑盒均購自日本TaKaRa；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega；電化學發光（electronics components laboratory，ECL）試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。實驗中涉及的引物及序列均有上海吉瑪公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分離、培養和處理

使用開胸法無菌摘取小鼠心臟，去除結締組織，用胰酶消化，收集細胞懸液。用新鮮含有10%胎牛血清的DMEM 培養基培養，再使用差速貼壁法將細胞在培養箱中培養2 h。其中貼壁細胞為心肌成纖維細胞，未貼壁的細胞為心肌細胞。將細胞常規培養至3～4 代后用于后續實驗。將心肌成纖維細胞標記為CF組，心肌細胞標記為CM組。使用脂質體對CF細胞進行處理，具體的處理方法為：取3～4倍的質粒或DNA 量的脂質體進行轉染，miR-NC組（轉染miR-NC）、miR-93-5p mimic 組（轉染miR-93-5p mimic）、inhibitor-NC組（轉染inhibitor-NC）、miR-93-5p inhibitor 組（轉染miR-93-5p inhibitor）、pcDNA組（轉染pcDNA）、pcDNA-Furin 組（轉染pcDNA-Furin）、si-NC組（轉染si-NC）、si-Furin 組（轉染si-Furin）、miR-93-5p mimic+pcDNA組載體（共轉染miR-93-5p mimic和pcDNA）、miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 組（共轉染miR-93-5p mimic和pcDNA-Furin），將其轉染8 h 后，棄去培養基，用新培養基再培養48 h，用qRTPCR 驗證轉染是否成功，將轉染成功的細胞用于后續試驗。若轉染不理想，需要調整轉染條件，更換質粒，進行重新轉染，直至轉染成功，才可用于后續實驗。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細胞中miR-93-5p、Furin 的表達

詳細步驟參考文獻[6]，miR-93-5p、Furin 以U6、GAPDH為內參，2-△△Ct法計算miR-93-5p、Furin 的相對表達。引物信息（5′-3′）：miR-93-5p，上游引物GCCATGTAAACATCTCGGACTG，下游引物CAATGCGTGTGGTGGAGGAG；U6，上游引物GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT；Furin 上游引物CCAGAGCGCCCTTTGAAA，下游引物CCAGTCGCAAGATAAAAAAATACTTTG；GAPDH，上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG，下游引物 TGCCATGGGTGGAATCATATTGG；PCR 條件：95℃15 min，94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s，共40個循環。

1.2.3 Western blot 檢測細胞中Furin、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達

用0.25 %胰酶消化、收集細胞，用蛋白裂解液充分將其裂解。然后進行總蛋白的提取，定量和變性。用變性后的蛋白上清液進行蛋白電泳上樣，結束后將蛋白從膠上轉移至PVDF 膜。然后將膜進行倍比稀釋的相應一抗（1∶500～1 500）溶液中孵育過夜（4℃）。取出膜，將其浸入相應倍稀釋的二抗（1∶1 000）溶液中孵育2 h（37℃）。最后，用ECL顯色液進行顯影、曝光，將圖片用Quantity One 4.62 軟件進行分析，用目的條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值表示蛋白的表達。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞的熒光活性

構建包含miR-93-5p 結合位點的Furin 野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-Furin、MUTFurin，將其分別與miR-NC、miR-506-3p 共轉染至CF 細胞，轉染48 h，按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.2.5 統計學處理

用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-93-5p、Furin 在心肌成纖維細胞中的差異表達

運用qRT-PCR和Western blot 檢測CM、CF 細胞中miR-93-5p、Furin 的表達情況。與CM 組相比，CF 組細胞中miR-93-5p mRNA 表達顯著升高，Furin 的mRNA和蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 miR-93-5p、Furin在心肌成纖維細胞中的差異表達（±s）Table1 Differential expression of mir-93-5p and furin in cardiac fibroblasts（±s）

表1 miR-93-5p、Furin在心肌成纖維細胞中的差異表達（±s）Table1 Differential expression of mir-93-5p and furin in cardiac fibroblasts（±s）

組別CM 組CF 組t值P值miR-93-5p mRNA 1.01±0.06 1.28±0.11 6.464 0.000 Furin mRNA 1.00±0.08 2.54±0.15 27.176 0.000 Furin 蛋白0.99±0.07 1.53±0.11 12.424 0.000

2.2 miR-93-5p對成纖維細胞纖維化的影響

與miR-NC組相比，miR-93-5p mimic 組心肌成纖維細胞中miR-93-5p mRNA 表達顯著升高，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達均顯著降低；與inhibitor-NC組相比，miR-93-5p inhibitor 組心肌成纖維細胞中miR-93-5p mRNA 表達顯著降低，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 miR-93-5p 調控成纖維細胞纖維化相關蛋白的表達（±s）Table2 miR-93-5p regulates the expression of fibrosis related proteins in fibroblasts（±s）

表2 miR-93-5p 調控成纖維細胞纖維化相關蛋白的表達（±s）Table2 miR-93-5p regulates the expression of fibrosis related proteins in fibroblasts（±s）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與inhibitor-NC組比較，bP＜0.05。

組別miR-NC組miR-93-5p mimic 組inhibitor-NC組miR-93-5p inhibitor 組F值P值miR-93-5p mRNA 1.02±0.07 2.94±0.16a 0.97±0.06 0.20±0.12b 681.816 0.000蛋白CollagenⅠ0.99±0.08 0.67±0.05a 0.96±0.07 1.68±0.14b 197.784 0.000 CollagenⅢ1.02±0.08 0.77±0.06a 0.98±0.07 1.37±0.12b 76.054 0.000 TIMP2 1.01±0.09 0.52±0.04a 0.96±0.05 1.67±0.13b 278.185 0.000 Fibronectin 1.00±0.08 0.42±0.03a 0.99±0.08 1.71±0.13b 320.894 0.000

2.3 miR-93-5p 靶向Furin

通過Stabase 2 軟件預測到Furin 可能是miR-93-5p 的靶基因（圖1A）；雙熒光素酶實驗結果見表3，miR-93-5p mimic 組相較于miR-NC組可顯著降低Furin-WT 細胞的熒光素酶活性，miR-93-5p inhibitor 組相較于inhibitor-NC組可顯著升高Furin-WT細胞的熒光素酶活性；Western blot 檢測顯示，miR-93-5p mimic 組相較于miR-NC組Furin 蛋白表達顯著降低，miR-93-5p inhibitor組相較于inhibitor-NC組Furin 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見表3和圖1B。

2.4 Furin 對成纖維細胞纖維化的影響

與pcDNA組相比，pcDNA-Furin 組細胞中Furin mRNA和蛋白表達均顯著升高，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達均顯著升高；與si-NC組相比，si-Furin 組細胞中Furin mRNA和蛋白表達均顯著降低，CollagenⅠ、Colla-genⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表3 miR-93-5p 靶向Furin（±s）Table3 miR-93-5p targeting furin（±s）

表3 miR-93-5p 靶向Furin（±s）Table3 miR-93-5p targeting furin（±s）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與inhibitor-NC組比較，bP＜0.05。

組別miR-NC組miR-93-5p mimic 組inhibitor-NC組miR-93-5p inhibitor 組F值P值熒光活性Furin-WT 0.99±0.08 0.27±0.02a 0.99±0.06 1.77±0.12b 517.655 0.000 Furin-MUT 1.00±0.06 0.98±0.09a 0.97±0.08 1.02±0.10b 0.629 0.601 Furin蛋白1.00±0.08 0.68±0.06a 0.97±0.07 1.49±0.12b 138.634 0.000

表4 Furin 對成纖維細胞纖維化的影響（±s）Table4 Effect of furin on fibroblast fibrosis（±s）

表4 Furin 對成纖維細胞纖維化的影響（±s）Table4 Effect of furin on fibroblast fibrosis（±s）

注：與pcDNA組比較，aP＜0.05；與si-NC組比較，bP＜0.05。

組別pcDNA組pcDNA-Furin 組si-NC組si-Furin 組F值P值Furin mRNA 1.00±0.05 1.95±0.12a 0.99±0.06 0.32±0.03b 755.943 0.000蛋白Furin 1.02±0.09 1.64±0.09a 0.96±0.07 0.72±0.06b 224.016 0.000 CollagenⅠ1.01±0.08 1.82±0.15a 0.99±0.09 0.67±0.06b 213.243 0.000 CollagenⅢ1.00±0.08 1.49±0.13a 0.99±0.08 0.70±0.06b 116.072 0.000 TIMP2 1.02±0.09 1.55±0.12a 1.01±0.07 0.68±0.05b 155.919 0.000 Fibronectin 0.97±0.09 1.44±0.12a 0.99±0.08 0.52±0.04b 166.583 0.000

2.5 Furin 回復miR-93-5p對成纖維細胞纖維化的調控作用

與miR-93-5p mimic+pcDNA組相比，miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 組細胞中miR-93-5p mRNA表達顯著降低，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表5 Furin 回復miR-93-5p對成纖維細胞纖維化的調控作用（±s）Table5 Regulatory effect of furin on fibroblast fibrosis by recovering miR-93-5p（±s）

表5 Furin 回復miR-93-5p對成纖維細胞纖維化的調控作用（±s）Table5 Regulatory effect of furin on fibroblast fibrosis by recovering miR-93-5p（±s）

注：與miR-93-5p+pcDNA組比較，aP＜0.05。

組別miR-93-5p mimic 組miR-93-5p mimic+pcDNA組miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 組F值P值蛋白miR-93-5p mRNA 1.02±0.08 0.99±0.09 0.76±0.06a 30.182 0.000 CollagenⅠ0.99±0.08 1.02±0.09 1.23±0.10a 18.844 0.000 CollagenⅢ1.00±0.08 0.98±0.09 1.31±0.11a 34.748 0.000 TIMP2 0.98±0.08 1.00±0.07 1.43±0.09a 89.953 0.000 Fibronectin 1.01±0.08 0.97±0.08 1.52±0.10a 111.355 0.000

3 討論

miRNAs 在心肌梗死的發生、發展過程中起著關鍵的作用[8]，但是miR-93-5p 在心肌梗死中的功能仍有待進一步開發。Liu 等[9]在研究中發現，包含miR-93-5p 的脂肪間充質干細胞（adipose-derived stromal cells，ADSC）外泌體能夠顯著的增強單純使用ADSC 對急性心肌梗死大鼠的心肌治療作用，并且這種機制與miR-93-5p 可分別通過靶向自噬相關基因（recombinant autophagy related protein 7，Atg7）和Toll 樣受體4（toll like receptor，TLR4）來抑制缺氧誘導的自噬和炎性細胞因子的分泌相關。Li 等[10]報道，miR-93 在冠狀動脈疾病（coronary artery disease，CAD）患者血液中升高，但其可抑制心肌細胞凋亡，保護心肌細胞免受缺血再灌注的損傷，但在抑制miR-93 的小鼠模型中，能夠加速心臟重塑的惡化。Zhong 等[11]在急性心肌梗死組織的差異miRNA 分析中報道，miR-93-5p 的表達異常升高。

Furin是一種分泌型前蛋白轉化酶，可通過在一個或多個內部位點進行有限的蛋白水解，將前體蛋白激活為生物活性形式[12]。其參與多種蛋白質前體的成熟，包括生長因子、跨膜受體、內分泌激素和粘附分子[13]。Furin 的多種潛在底物與心臟分化和發育的不同方面有關，例如，骨形態發生蛋白4抗體（bone morphogenetic protein 4，Bmp4）對于流出道（outflow tract，OFT）和房室（atrioventricular，AV）分隔是必需的，并受Furin 影響[14]。此外，攜帶突變的小鼠破壞了proBmp4 對Bmp4 的有序分裂，表現出發育異常，包括心血管缺陷[15]。王玨等[16]報道，在心臟成纖維細胞中，Furin 作為miR-24 的靶標，參與小鼠心臟成纖維細胞的膠原合成、增殖、遷移過程。本實驗發現，Furin 在大鼠心臟成纖維細胞中表達上調，并且下調Furin 能夠抑制心臟成纖維細胞中纖維化相關蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的表達，而上調Furin 則具有相反的作用。這些實驗結果均與上述前人的研究結果相吻合。miR-93-5p和Furin 在心肌梗死成纖維細胞中的表達雖都為上調，但是二者發揮的功能是相反的，這可能與機體在疾病發展的不同階段具有不同的生理病理學特性有聯系，發生這種作用的機制可能還與其他因素（miRNA 的調控網絡）相關，這有待進一步的深入研究。

綜上所述，miR-93-5p 具有抑制心臟成纖維細胞纖維化的作用，其機制與靶向抑制Furin 有關，為心肌梗死的治療提供新靶點。