miR-223和miR-192在重癥肺炎患兒血清中的表達意義

孫卉芳 孫永法 王丹鳳

肺炎是兒童時期尤其是嬰幼兒時期最為常見的呼吸道感染性疾病。臨床根據病情嚴重程度，將肺炎分為輕癥肺炎和重癥肺炎，前者癥狀輕、無并發癥、預后好；后者起病急、變化快、病情重、并發癥多，常可危及兒童生命，是導致5歲以下兒童死亡的主要原因[1-2]。在肺炎患兒中，有8%～14%屬于重癥肺炎。兒童重癥肺炎具有發病快、并發癥多，常累及全身、典型表現常被掩蓋或被忽略等特點，如果搶救時間倉促極易導致診治不當，會使病情進展惡化，甚至死亡。因此，對兒童重癥肺炎的診斷和正確治療是兒科的重大課題[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子非編碼的基因表達調控因子，介導轉錄后的基因沉默，它是一類高度保守、長度很短的內源性非編碼單鏈RNA，約20～24 nt。他們參與了許多生物過程，包括新陳代謝、細胞周期、細胞凋亡和疾病控制，在心血管、呼吸、神經和造血系統等多個系統內都發揮作用，還報道了miRNA 參與紅細胞生成和血管生成。大量研究表明miRNA 與肺的生長發育、肺炎、肺癌以及肺纖維化等肺部疾病的發生發展及轉歸有著密切的聯系[5-6]。本實驗旨在研究miR-223 與miR-192在重癥肺炎患兒中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年1月本院收治的120例肺炎患兒為研究組，男性66例，女性54例，平均（3.56±1.20）歲。同時選取同期健康體檢兒童120例為對照組，其中男性60例，女性60例，平均（3.85±1.33）歲。根據重癥肺炎診斷標準將研究組患兒分為輕度感染組、中度感染組與重度感染組，各40例[7]。本研究經本院倫理委員會批準，所有患兒家屬知情且簽署同意書。經影像學檢查顯示患兒具有片狀浸潤陰影、間質性肺炎等炎性改變，自身有一定的免疫性疾病。排除標準：既往窒息病史者；先天性心臟病、支氣管發育不良等先天性疾病者；合并吸入性肺炎、敗血癥等感染性疾病者；意識障礙等；家族性疾病患兒。對照組與研究組患兒性別、年齡等資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

抽取各組患兒清晨空腹靜脈血5 mL，4℃條件下經3 000 r/min 離心15 min，吸取上清至EP 管內，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-223、miR-192 的表達水平

采用Trizol（美國Invitrogen公司）法血清中的總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA 濃度。根據反轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher公司）說明書操作將總RNA 反轉錄合成cDNA。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA 為模板進行qRT-PCR反應，反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補足體系至20 μL；反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環40次。miR-223、miR-192 以U6 為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.2.3 檢測血清ApoE、CRP、PCT水平

采用免疫比濁法檢測血清載脂蛋白E（ApoE，apolipoproteinE）與C-反應蛋白（CRP，C-reactive protein）的水平，檢測儀器日立HITACHI7180 與配套試劑購自東莞市毅萬光源有限公司；采用化學發光法檢測血清降鈣素原（PCT，procalcitonin）的水平，mini-VIDAS 免疫分析儀及其配套試劑購自法國生物梅里埃股份有限公司。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，計數資料采用n（%）表示，行χ2檢驗；采用Pearson 法分析重癥肺炎患兒血清miR-223、miR-192 相關性及其兩者表達與ApoE、CRP、PCT水平的相關性；受試者工作特征（ROC，receiver operating characteristic）曲線分析血清miR-223、miR-192 對重癥肺炎的診斷價值。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-223 與miR-192 的表達水平和ApoE、CRP、PCT水平比較

與對照組相比，研究組血清miR-223 的表達水平顯著升高，血清miR-192 的表達水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與對照組相比，研究組血清ApoE、CRP、PCT水平顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組血清miR-223、miR-192 的表達水平和ApoE、CRP、PCT水平比較（±ss）Table2 Comparison of the expression levels of serum miR-223 and miR-192 and the levels of ApoE，CRP and PCT between the 2 groups（±s）

表2 兩組血清miR-223、miR-192 的表達水平和ApoE、CRP、PCT水平比較（±ss）Table2 Comparison of the expression levels of serum miR-223 and miR-192 and the levels of ApoE，CRP and PCT between the 2 groups（±s）

組別對照組研究組t值P值n 120 120 miR-223 1.68±0.30 2.27±0.38 27.391 0.000 miR-192 0.90±0.25 0.45±0.30 20.651 0.000 ApoE（mg/dL）2.33±0.47 5.98±0.96 13.951 0.000 CRP（mg/L）5.21±1.89 10.35±2.67 13.695 0.000 PCT（ng/mL）0.15±0.03 0.37±0.10 15.632 0.000

2.2 不同感染程度患兒血清miR-223 與miR-192的表達水平比較

與輕度感染組相比，中度感染組與重度感染組血清miR-223 的表達水平顯著升高（P＜0.05），血清miR-192 的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

2.3 重癥肺炎患兒血清miR-223與miR-192相關性

Pearson 相關性分析結果顯示，重癥肺炎患兒血清中miR-223 與miR-192表達呈負相關（r=-0.226，P＜0.001）。見圖1。

2.4 重癥肺炎患兒血清miR-223 與miR-192 與ApoE、CRP、PCT 的相關性分析

采用Pearson 法結果顯示miR-223 與ApoE、CRP、PCT 呈正相關（P＜0.05），miR-192 與ApoE、CRP、PCT 呈負相關（P＜0.05），見表4。

表3 不同感染程度血清miR-223 與miR-192 的表達水平比較（±s）Table3 Expression levels of serum miR-223 and miR-192 at different infection levels（±s）

表3 不同感染程度血清miR-223 與miR-192 的表達水平比較（±s）Table3 Expression levels of serum miR-223 and miR-192 at different infection levels（±s）

注：與輕度感染組相比，aP＜0.05。

組別輕度感染組中度感染組重度感染組F值P值n 40 40 40 miR-223 1.91±0.32 3.21±0.56a 3.69±0.45a 25.669 0.000 miR-192 0.85±0.29 0.45±0.21a 0.40±0.25a 30.587 0.000

表4 肺炎患兒血清miR-223、miR-192 與ApoE、CRP、PCT的相關性分析Table4 Correlation analysis of serum miR-223，miR-192 and ApoE，CRP，PCT in children with pneumonia

2.5 血清miR-223 與miR-192 對重癥肺炎的診斷價值

ROC 分析血清miR-223、miR-192 以及兩個基因聯合對重癥肺炎的診斷價值。miR-223、miR-192 診斷重癥肺炎時的敏感度、特異度、AUC 面積、Z值，尤登指數、標準誤值等，見表5。

表5 血清miR-223與miR-192對重癥肺炎的診斷價值Table5 Diagnostic value of serum miR-223 and miR-192 in severe pneumonia

3 討論

重癥肺炎是一種呼吸系統急危重疾病，發展迅速、病情兇險，應快速采取針對性措施進行綜合治療以改善患兒預后。重癥肺炎表現為肺部癥狀呼吸衰竭，還有全身中毒癥狀，其他臟器功能不全甚至衰竭，即常見的膿毒血癥。膿毒癥的感染灶分布于全身各處，臨床常見于肺部、腹膜、膽道系統、泌尿生殖系及腦膜炎等，皮膚膿腫也可引起膿毒癥，常常表現為全身炎癥反應綜合征。重癥肺炎可導致膿毒癥的發生，而膿毒癥也最常累及肺部，是引起呼吸衰竭最常見的原因，兩者互相影響。膿毒癥也是重癥肺炎患兒的主要死亡原因之一[8-9]。醫院獲得性肺炎是重癥患兒高死亡率的重要原因之一，其死亡率大約在33%～50%[10]，其主要病原菌是銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌，如若推遲抗感染治療時間，死亡率將增加至60%[11-12]。

miRNA 在細胞分化，生物發育及疾病發生發展過程中發揮巨大作用，越來越多的引起研究人員的關注。隨著對于miRNA 作用機理的進一步的深入研究，以及利用最新的技術miRNA 芯片等高通量的技術手段對于miRNA和疾病之間的關系進行研究，將會使人們對于高等真核生物基因表達調控的網絡理解提高到一個新的水平。顏保松等[13]研究表明，miR-223 可作為肺結核潛在的有診斷價值的標記物。柳新勝等[14]研究表明，miR-192 可以評估相關性肺炎患兒病情嚴重程度。

綜上所述，重癥肺炎患兒血清miR-223表達水平升高，miR-192的表達水平降低，且與肺炎嚴重程度有關，并可能作為早期診斷重癥肺炎的分子標志物，臨床中對重癥肺炎患兒應給予早期有效診斷，并進行適當的治療，可有效提高臨床療效。