結(jié)核感染致胸壁腫物的病原檢測方法的比較研究

曾定科 趙健

胸壁腫物是指胸壁組織病變，致胸壁皮膚隆起的一種表現(xiàn)，屬胸壁疾病的范疇。而結(jié)核感染致的胸壁腫物最為常見，嚴重危害人類的健康。結(jié)核感染引起的疾患，統(tǒng)稱為結(jié)核病，是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，潛伏期多在4～8周之間。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，其中80%發(fā)生在肺部，其他部位，除毛發(fā)，指甲外，均可發(fā)生結(jié)核菌繼發(fā)感染，如頸淋巴、腸道、骨骼、胸膜，胸壁等。結(jié)核病的主要傳染方式為呼吸道傳染。傳染源主要是痰菌陽性（涂片及培養(yǎng)陽性）的患者。隨著環(huán)境污染及人類免疫缺陷病毒的傳播，結(jié)核病發(fā)病率并未得到有效控制。臨床上除少數(shù)發(fā)病急促外，如干酪性肺炎，結(jié)核病發(fā)病過程多呈慢病改變。常有午后潮熱，乏力、消瘦等結(jié)核中毒癥狀，多伴咳嗽、咳痰等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)。結(jié)核病分為肺結(jié)核與肺外結(jié)核，肺外結(jié)核以淋巴結(jié)結(jié)核最為常見占肺外結(jié)核的20%～50%，占所有結(jié)核病的4.0%～5.1%[1-2]，是肺外結(jié)核中最為常見的疾患之一。而結(jié)核感染所致胸壁腫物，指的是繼發(fā)于肺或胸膜結(jié)核感染的肋骨、胸骨、胸壁軟組織結(jié)核病變，其作為肺外結(jié)核的另一種表現(xiàn)，雖然較為少見，但其復發(fā)率較高，除結(jié)核藥物化療外，多需手術(shù)干預，影響著人類的健康和生活，本文以胸壁腫物為疾病背景，結(jié)合臨床與檢驗展開研究。

目前，結(jié)核病的確診主要有賴于病原學（結(jié)核菌涂片與培養(yǎng)）或病理學檢查[3-4]。而病理以及結(jié)核菌培養(yǎng)檢查時間長，結(jié)核菌涂片檢查時間雖短但，敏感性不高[5-6]。因此，臨床迫切需要尋找一種快速、準確的檢測手段。近年來興起的GeneXpert Mtb/RIF 法，運用GeneXpert 檢測系統(tǒng)，是一種PCR 檢測手段，可在體外對結(jié)核分枝桿菌進行檢測，以及提供針對利福平的耐藥性檢測。它的準確性高：可檢測低含菌量，低濃度的標本，更靈敏；檢測快速：最快可在2小時內(nèi)出結(jié)果；檢測利福平是否耐藥：能盡早檢測并提示利福平耐藥情況，使耐藥病人得以及時治療；適用標本類型多樣：可在痰液、尿液、膿液、病灶、腦脊液、支沖液、胸腹水、胃液及淋巴組織等中檢出[7]。本文回顧分析了本院在“結(jié)核所感染致胸壁腫物”患者中GeneXpert MTB/RIF 的應用情況，探討該試驗對于“結(jié)核感染致胸壁腫物”患者的診斷與治療的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究對象為2017年1月1日～2018年12月31日在廣州市胸科醫(yī)院因“胸壁腫物”，臨床考慮結(jié)核感染引起，故行胸壁病灶清除手術(shù)，同時在手術(shù)中留取病灶或膿液行GeneXpert Mtb/RIF、r-干擾素釋放試驗（IGRAs）、結(jié)核菌培養(yǎng)、結(jié)核菌涂片檢驗及病理檢查的患者，總共69例。其中有9例經(jīng)病例確定為非結(jié)核感染（分別為非結(jié)核分枝桿菌感染4例，郎格汗斯細胞組織細胞增多癥、肌內(nèi)血管瘤、慢性炎癥、神經(jīng)纖維瘤、軟骨肉瘤各1例），60例病理示結(jié)核，確定為結(jié)核感染。

1.2 方法

1.2.1 GeneXpert 法

取膿液或病灶樣本1 mL，置入處理管中，然后加入處理液，蓋好瓶蓋于渦旋振蕩器上振蕩15～30 s 后，平靜狀態(tài)下放置15 min，待標本充分液化后，取2 mL 處理后的標本置于反應盒中，然后將反應盒置于GeneXpert MTB／RIF 檢測系統(tǒng)中自動檢測。待反應結(jié)束后，時間大約為2 h，檢測結(jié)果可直接在檢測系統(tǒng)窗口下觀察。

1.2.2 結(jié)核菌涂片（液基夾層杯法）

標本先經(jīng)離心濃縮集菌后涂片，用臘筆將涂面局部隔開，滴加石炭酸復紅染液（稱取堿性復紅4 g，溶于95%酒精100 mL 中成飽和液。再取飽和液10 mL 與5%石炭酸溶液90 mL 混勻即成），酒精燈上加熱至出現(xiàn)蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液干涸。如有干涸的趨勢，應及時補加染液。持續(xù)染色5～8 min，待冷后流水漂去多余的染液。用3%鹽酸酒精清（取濃鹽酸3 mL，95%酒97 mL 混合）脫色，脫至涂面無色為止，約1～3 min，自來水沖洗。加亞甲基藍溶液，染色30 s，水洗干燥后，通過顯微鏡檢查。結(jié)果判定按照中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會制訂的實驗室檢查規(guī)程進行[8]。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)（液體法）

標本材料經(jīng)前期酸堿處理后接種于液體培養(yǎng)基內(nèi)，35℃培養(yǎng)約2周，觀察培養(yǎng)基表面生長菌膜。

1.2.4 IGRAs 法

用BD.CPT 管提取液收集外周血單個核細胞，結(jié)核特異性抗原（ESAT-6/CFP-10）刺激結(jié)核特異性的T淋巴細胞使其分泌r-干擾素，效應T淋巴細胞分泌的r-干擾素與模板預包被的抗r-干擾素抗體結(jié)合并固定在細胞周圍，過夜孵育，加入酶標二抗，加入底物底物工作液，計算斑點數(shù)[9]。

1.3 統(tǒng)計學分析

根據(jù)SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件計數(shù)資料用n（%）表示，使用配對，使用配檢驗公式法驗公式（b-c）2/b+c，V（即自由度）=1 計算GeneXpert Mtb/RIF、IGRAs、結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)在靈敏性上是否存在差別，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

4種檢測法的靈敏度、一致率從高到低排序為GeneXpert Mtb/RIF、IGRAs、結(jié)核菌培養(yǎng)、結(jié)核菌涂片。見表1。

表1 以病理診斷為標準4種方法檢測的診斷效能[n（%）]Table1 Diagnostic efficacy of 4 methods based on pathological diagnosis[n（%）]

3 討論

胸壁腫物作為胸壁疾病的種類之一，最常見的病因為結(jié)核感染所致，與本研究結(jié)果一致。我國作為結(jié)核病高發(fā)的國家，雖然已采取一系列措施遏制結(jié)核病，但其仍是危害公共衛(wèi)生安全的全球問題之一，仍有較高的發(fā)病率和致殘致死率。當前結(jié)核病疫情雖然出現(xiàn)緩慢下降的趨勢，但由于耐多藥結(jié)核病的增多，人類免疫缺陷病毒和結(jié)合菌的雙重感染和移民及流動人口中結(jié)核病難以控制[10-11]，結(jié)核病仍未得到有效控制，嚴重危害著人類的身體健康。因此，作為臨床一線工作者，快速而準確的檢驗檢查方法顯得尤為重要，需不斷的探索與研究。

目前結(jié)核病診斷的金標準仍是病原學（即結(jié)核菌涂片及結(jié)核菌培養(yǎng)）或病理學診斷，但是，傳統(tǒng)的涂片方法，耗時較短，但陽性率低，而培養(yǎng)方法培養(yǎng)周期長，不能在短時間內(nèi)得到結(jié)果，難以為患者達到早期快速診斷和治療的目的[5-6]；至于病理檢查，由于非結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)現(xiàn)越來越多，其病理檢查結(jié)果有時候極為相似，其金標準的地位也有所動搖。本研究收集經(jīng)手術(shù)取病理確定為“胸壁結(jié)核”，且標本分別進行GeneXpert Mtb/RIF、結(jié)核菌涂片，結(jié)核菌培養(yǎng)的患者，評價4種檢測技術(shù)對診斷“胸壁結(jié)核”應用價值。結(jié)果顯示，GeneXpert Mtb/RIF 的靈敏性明顯高于結(jié)核菌涂片及培養(yǎng)，在肺結(jié)核與肺外結(jié)核都有重要的診斷及應用價值[12-15]，本實驗研究也證實了這一點。其次，GeneXpert Mtb/RIF 所提供的利福平耐藥檢測在結(jié)核治療方面有重要指導意義[16-17]，本次研究的60例“胸壁結(jié)核”患者中，有4例患者GeneXpert Mtb/RIF 檢測出利福平耐藥，而這4例患者結(jié)核菌培養(yǎng)均陽性，藥敏提示均對利福平耐藥，從中可以看出其有著非常高的一致性，可為臨床醫(yī)師制定結(jié)核化療方案提供預警。另外，本研究的另一種檢測方法，IGRAs 已作為結(jié)核病診斷指南的標準之一[18]，但其出結(jié)果時間較長，一般需兩天后出結(jié)果，廣州市胸科醫(yī)院醫(yī)院，是華南地區(qū)最大的結(jié)核專科醫(yī)院，有國家重點專科實驗室，但目前情況，IGRAs 也只能一周做兩次，而GeneXpert Mtb/RIF 檢測方法在敏感性方面與其旗鼓相當，且GeneXpert 法出結(jié)果時間短，最快2小時出就有結(jié)果，且能提供利福平敏感試驗，在快速診斷方面有更大的優(yōu)勢。

綜上所述，GeneXpert Mtb/RIF 在“結(jié)核感染致胸壁腫物”患者中具有良好的敏感性與特異性，對診斷這類患者具有重要臨床應用價值。并且能夠在短時間內(nèi)（2 h 左右）得以診斷，能夠有效縮短患者的診斷時間，提高診斷效率，優(yōu)于抗酸桿菌涂片和結(jié)核菌培養(yǎng)傳統(tǒng)診斷方法，同時其所提供的利福平耐藥檢測與結(jié)核菌培養(yǎng)藥敏結(jié)果有著非常高的一致性，可以對結(jié)核病早期化療方案制定提供依據(jù)，值得臨床推廣應用。