Prader-Willi綜合征及Angelman綜合征的遺傳學分析方案及廣東的臨床實踐

汪安石 劉暢 王繼成 黃演林 張彥 丁紅珂 劉玲 楊杰 吳菁 尹愛華★

Prader-Willi 綜合征（Prader-Willi syndrome，PWS，OMIM 176270）及Angelman 綜合征（Angelman syndrome，AS，OMIM 105830）是一對由基因組印記異常所致的疾病。Prader-Willi 綜合征為父源染色體15q11.2-q13 區域印記基因的功能缺陷所致，Angelman 綜合征是由母源染色體15q11.2-13上編碼泛素蛋白連接酶E3 的UBE3A基因缺失或表達異常所致。二者共同的分子病理基礎包括：染色體15q11.2-q13 片段缺失、單親二倍體（uniparentaldisomy，UPD）、印記中心（imprinting centre，IC）缺陷及突變等[1-4]。PWS 與AS 在國外不同人群中報道的發病率間于1/15 000～1/25 000[1]，我國尚缺乏系統的流行病學研究數據[2]。

PWS和AS 的遺傳學分析方案的制定取決于多因素，包括醫保政策、轉診模式、實驗室配置、實驗技術的檢測效力與檢測成本等。目前診斷PWS和AS 最敏感的單一方法是使用分子遺傳學技術分析15q11-q13 區域內的甲基化模式，通過分析母源性/父源性甲基化印跡來檢測缺失、UPD和印跡缺陷。本研究設計了一套適合廣東地區實際情況的PWS及AS 的遺傳學分析方案，并將其應用于廣東地區的臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2013年7月至2017年12月經廣東省婦幼保健院醫學遺傳中心確診的39例Prader-Willi 綜合征患兒及15例Angel man 綜合征患兒的臨床表現及遺傳學特征。39例PWS 患兒中男24例、女15例（男女比例1.6∶1），確診年齡間于8 天至6歲，新生兒期（≤28 d）確診26例（平均年齡5.75天、標準偏差6.72）、嬰兒期（29 d至1歲）確診10例、幼兒期（1歲至3歲）確診1例、學齡（前）期至青春期（＞3歲）確診患兒2例。39例PWS 患兒主要臨床表現為嬰幼兒期肌張力低下、哭聲微弱、反應差、喂養困難、性腺發育不良及皮膚色素減退、嬰兒期后精神運動發育遲緩、認知行為異常、食欲旺盛、肥胖癥、身材矮小（各年齡段的臨床表現如表1 所示）。15例AS 患兒中男10例、女5例（男女比例2∶1），確診年齡間于9 d至4歲，新生兒期確診5例（平均年齡16.1 d、標準偏差9.08）、嬰兒期4例、幼兒期5例、＞3歲患兒1例。15例AS 患兒主要臨床表現為新生兒期喂養困難、嬰兒期后出現明顯發育延遲、運動或平衡障礙、爆發性大笑、肌張力低下、異常特征性EEG（各年齡段的臨床表現如表2 所示）。收集患兒臨床資料，包括母孕期情況、患兒體貌特征、肌力和肌張力、神經系統發育情況、性腺發育情況、平衡能力、特征性行為、語言發育情況、輔助檢查結果等。該研究經廣東省婦幼保健院倫理委員會審核通過。病例采集獲受檢者父母知情同意。

1.2 遺傳學分析策略

本研究根據國家醫保政策、廣東省遺傳代謝性疾病基本情況、本單位婦幼謝性疾病實驗室配置等，綜合考慮各項實驗技術的檢測效力與檢測成本，設計了一套適合廣東地區實際情況的PWS及AS 的遺傳學分析方案（圖1）。

表1 Prader-Willi 綜合征患兒各階段臨床表現[n（%）]Table1 Clinical manifestations in children at different ages with Prader-Willi syndrome[n（%）]

表2 Angelman 綜合征患兒各階段臨床表現[n（%）]Table2 Clinical manifestations in children at different ages with Angelman syndrome[n（%）]

1.3 甲基化特異性PCR

將基因組DNA 用CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit（Millipore，CA，USA）進行亞硫酸鹽修飾，以正常人為陰性對照、明確診斷患者為陽性對照、未修飾基因組DNA 為系統對照，應用M（母源）、P（父源）兩對引物同時對修飾后產物進行PCR擴增，擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離。引物序列及PCR反應條件參見文獻[5]。檢測結果呈如下幾種情況：正常對照同時顯示M（174 bp）、P（100 bp）兩條帶；PWS 陽性對照均僅顯示M 帶；AS 陽性對照均僅顯示P 帶；未經修飾的系統對照不顯示任何條帶。

1.4 微衛星STR 連鎖分析

根據UCSC Genome Bioinformatics 提供的遺傳信息及常見的斷裂熱點，選擇了15q11-13 關鍵區 內 的7個 位 點D15S11、D15S646、D15S817、D15S128、D15S1513、GABRB3、D15S822及2個區外位點D15S659、FES，用于患兒核心家系的STR連鎖分析，以明確患兒的分子缺陷類型。引物序列及PCR反應條件參見文獻[6]。

1.5 UBE3A基因序列分析

對于疑似AS 而甲基化特異性PCR 檢測陰性的病例，進行UBE3A編碼區及臨近內含子區序列分析。引物序列及PCR反應條件參見文獻[7]。

1.6 染色體微陣列分析

對于需要進一步明確染色體斷裂位點的病例或具有類PWS/類AS 臨床表現而上述檢測未能診斷的病例，通過染色體微陣列技術進一步分析。檢測數據與OMIM、DECIPHER、DGV及PubMed等數據庫信息比對。

2 結果

2.1 甲基化特異性PCR

39例患兒的檢測結果僅顯示M 帶，提示為PWS；15例僅顯示P 帶，提示為AS。

2.2 微衛星STR 連鎖分析

32例患兒在15q11-13 區域內只有母源染色體來源片段，缺乏父源染色體來源片段，而在15q11-13 區域外均有父母雙方來源的染色體片段，提示分子病理類型為缺失型PWS。7例患兒有雙拷貝母源染色體來源片段，缺乏父源染色體來源片段，提示為母源單親二倍體所致PWS。14例患兒在15q11-13 區域內只有父源染色體來源片段，缺乏母源染色體來源片段，而在15q11-13 區域外均有父母雙方來源的染色體片段，提示分子病理類型為缺失型AS。1例患兒有雙拷貝父源染色體來源片段，缺乏母源染色體來源片段，提示為父源單親二倍體所致AS（表3）。

表3 Prader-Willi 綜合征及Angelman 綜合征患兒的分子病理類型[n（%）]Table3 The pattern of underlying genetic mechanisms in our cohort[n（%）]

2.3 UBE3A基因序列分析

4例臨床高度懷疑AS 而甲基化特異性PCR檢測為陰性的病例行UBE3A編碼區及臨近內含子區序列分析，未檢出UBE3A基因突變型AS。

2.4 染色體微陣列分析

21個PWS/AS 病例行染色體微陣列分析，并進一步明確染色體斷裂位點與缺失區域。59例具類PWS/類AS 臨床表現而上述檢測未能診斷的病例行染色體微陣列分析，檢出4例與PWS/AS 具有一定程度表型重疊的染色體微缺失/微重復綜合征，分別是1p36 微缺失綜合征1例、22q13.3 微缺失綜合征1例、Mowat-Wilson 綜合征1例以及Miller-Dieker 綜合征1例。

3 討論

本研究根據廣東地區遺傳代謝性疾病診斷的具體情況，設計了一套遺傳分析策略。以甲基化特異性PCR 作為首選篩查方法[6，8-9]。用基于多重熒光標記PCR 的STR 連鎖分析法對陽性病例進行分子致病機制探究[6-8，10]。對于臨床高度懷疑AS而甲基化特異性PCR 檢測陰性的病例，進行UBE3A編碼區及臨近內含子區序列分析[8]。而對于具有類PWS/類AS 臨床表現而上述檢測未能診斷的病例，進行染色體微陣列分析可能發現具有表型重疊的其它染色體微缺失/微重復綜合征[11]。本方案在PWS/AS 的甲基化研究中選擇了甲基化特異性PCR 法，而非可通過半定量方式同時檢測15q11q13 內拷貝數變化及DNA 甲基化狀態的MSMLPA 法，主要出于檢測成本考量。甲基化特異性PCR 檢測敏感性高、成本低，較適合本地區臨床實踐。此外，本研究選擇基于多重熒光標記PCR的STR 連鎖分析法而非SNP-array 法進行致病機制研究，主要從檢測成本、檢測時間、檢測效力等角度考慮。基于多重熒光標記PCR 的STR 連鎖分析法是一種經濟、快捷的分析方法，檢測成本約為30 元/核心家系，檢測分析時間約為5小時，且檢測結果直觀、易于判讀。SNP-array 法檢測成本較高，檢測時間較長，且僅能檢出缺失型及同源性單親二倍體型，而對于異源性及混合源性單親二倍體型則需補充雙親SNP-array 檢測結果一同分析，更增加了檢測成本。

將這一PWS/AS 遺傳學分析方案應用于廣東地區的臨床診療實踐，共診斷PWS 患兒36例、AS 患兒14例。PWS及AS 呈現隨年齡而異的時序化臨床癥候群、早期臨床表現與多種神經系疾病存在重疊性，因而早期臨床診斷存在一定困難。以往的研究中[6，12-14]，PWS 患者確診的年齡中位數間于0.8至19.8歲，AS 患者確診的年齡中位數間于0.9至6.2歲，延誤了最佳診療時機，對患者的預后及生存質量造成不良影響。本研究在廣東地區的臨床實踐中，將PWS及AS 患者的確診年齡中位數降至18 d及27 d。系統分析PWS及AS 的臨床和遺傳學特征，于早期明確疾病診斷并確定分子缺陷類型[15-16]，及早開展干預治療，有助于改善患兒預后[17-18]。