人工基質上附著生物膜的微生物群落結構分析

鐘銘晨，彭路菊，趙靜巖，鄧歡歡，葛利云*，梅琨

(1.溫州醫科大學 公共衛生與管理學院，浙江 溫州 325035； 2.浙江省流域水環境與健康風險研究重點實驗室，浙江 溫州 325035)

河流是陸地水生態系統的重要組成部分，相比自然河流，城市河流受長期人為的影響較大[1]，污染嚴重時則會制約經濟發展。新型生態護坡基質通過搭配種植植物固定在河岸邊，具有生態美觀、經濟適用、施工簡便等特點，對恢復河道的自凈能力及對微生態系統的形成具有促進作用，應用前景良好[2]。微生物在河流生態系統氮、磷的轉化中發揮重要的作用，因此，對城市河道基質上微生物的研究具有重要的生物學意義，并為生態治理和環境保護提供應用價值[3]。

由于校內河道水流較緩，處于相對靜止的狀態，能創造一個相對穩定的生境，為一些相關試驗的開展提供了良好的野外條件。本研究擬以人工基質上生物膜為研究對象，通過刮取基質上的生物膜得到待測樣品，采樣高通量測序技術分析不同環境條件下微生物的群落結構差異。高通量可以通過對16S rDNA、18S rDNA、ITS區域進行擴增測序[4]，16S rDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，具有10個保守區域和9個高變區域(V1～V9)。保守區在細菌中差異不大，高變區具有屬和種的特性。通過對某一段高變區序列(V4區或V3～V4區)進行PCR擴增后進行測序[5]。不同的16S rDNA序列的相似性高于97%就可將其歸屬為一個操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)，每個OTU近似對應于物種水平[6]。以16S rDNA擴增進行測序分析主要用于微生物群落多樣性和構成的分析，大大拓展了對環境微生物的微生態認知。通過研究2種不同環境下護岸基質上的微生物群落結構的多樣性，確定了優勢類群，可為河道特定功能菌群的進一步研究和環境對微生物的影響提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用的材料為聚氯乙烯或聚丙烯經亂絲熱熔相互搭接，再經模具擠壓成型的三維網狀基質。

1.2 樣品采集

采樣區域位于溫州醫科大學茶山校區一段河道內，根據采樣點的布設，分別從種植植物的基質上(A)和未種植植物的基質上(B)刮取生物膜樣品，樣品在每個基質距水面20和50 cm處刮取。樣品采集時間為2018年5月18日，用已滅菌的刀片和刷子刮取生物膜，置于已滅菌的2 mL的離心管中，盡快帶回實驗室中，于-80 ℃保存待測定。

1.3 高通量測序分析

樣品委托上海祥音生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 2500進行高通量測序。通過Barcode區分樣品序列，并對各樣本序列做質量控制，去除非特異性擴增序列及嵌合體。在97%的相似性水平下，基于OTU聚類，即獲得各OTU的物種分類信息，基于此對每個OTU進行物種分類和匯總，得出豐度數據表，再根據Chao1豐富度估計量，Shannon指數和Simpson指數，進而判斷生物群落的結構特點。數據整理采用Excel 2016，使用Origin 8.1軟件進行繪圖處理。進行各樣本多樣性指數、群落結構及種群相對豐度差異分析。

2 結果與分析

2.1 多樣性

Alpha多樣性反映的是單個樣品內部的物種多樣性，包括observed species、Chao1，Shannon及Simpson指數等。其中，OTU數為A50：12 143，A20：8 681，B50：11 919，B20：14 458。各樣品的OTU數存在較大差異，其中B20的OTU數量最高。通過observed_species和Chao1指數可以估計富集樣品的群落豐度，通過Shannon和Simpson指數可以估計樣品的群落多樣性。由表1可知，4個位點樣品的群落多樣性比較相近，而群落豐度上差異較大。

表1 不同位點纖維基質上物種的α多樣性指數

2.2 群落組成

各采樣點樣品中所含的微生物涉及21個門21個綱，并存在不少OTU歸為Unclassified。各樣品優勢門水平(相對豐度超過1%)的菌群組成情況見圖1。

圖1 不同位點基質上的物種在門水平上群落結構和分布

由圖1可知，取相對豐度高于0.1%的物種作為優勢物種，其中變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍藻細菌(Cyanobacteria)在各位點中所占比例最為明顯，為樣品中的優勢門，其中變形菌門具有最高的相對豐度，在A區的變形菌門的相對豐度達到39.3%左右，B區變形菌門相對豐度較A處低，大致在30.5%。

在纖維基質上，不同試驗位點存在顯著差異。在深層和淺層的纖維基質上附著的變形菌門(Proteobacteria)在2個采樣點變化趨勢基本一致，其中在A區，纖維基質上的變形菌門(Proteobacteria)大于B區，說明植物的搭配種植，提高了變形菌門(Proteobacteria)的生存環境，提高了其豐度。說明變形菌門(Proteobacteria)可能依賴于植物生長提供的環境，或者說有植物的基質能有利于變形菌門(Proteobacteria)的生長。

在纖維基質上不同試驗位點上存在顯著差異，在深層和淺層的纖維基質上附著的變形菌門在2個采樣點變化趨勢基本一致，其中在A區，纖維基質上的變形菌門大于B區，說明植物的搭配種植，提高了變形菌門的生存環境，提高了其豐度。說明變形菌門可能依賴于植物生長提供的環境，或者說有植物的基質能有利于變形菌門的生長。

根據表2，在A、B區，不同采樣深度也存在明顯差異，A20樣品中變形菌門、浮霉菌門豐度分別是42.5%和17.7%，均高于A50的豐度值。每個點的樣品微生物群落組成在其他門水平上也存在較大差異。擬桿菌門A區的相對豐度均低于B區，同時B50采樣點的豐度大于B20。

表2 不同位點纖維基質上優勢物種的分布比例

3 小結

Alpha多樣性反映的是單個樣品的物種多樣性，包括observed species、Chao1，Shannon及Simpson指數等。樣品不同的Alpha多樣性指數的數值中，observed species和Chao1指數反映了樣品中群落的豐度，即單指群落中物種數量，而不考慮群落中每個物種的豐度情況[7]。Shannon及Simpson指數反映群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。在物種豐富度相同的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性。Shannon和Simpson指數值越大，說明個體分配越均勻。若每一個體都屬于不同的種，Shannon和Simpson指數就大；若每一個體都屬于同一種，則Shannon和Simpson指數就小[7]。

在纖維基質上，A50處的Chaol和observed species指數略高于B50，Shannon和Simpson指數也均呈相同趨勢，說明種植植物區樣品的群落的豐度和多樣性高于無植物區。同時還發現，在兩處試驗點50 cm的Shannon和Simpson指數均大于20 cm處指數，說明在50 cm處物種多樣性相對較高。

物種豐度的分析是對每個OTU進行物種分類。結果表明，變形菌門、浮霉菌門在每個樣品中均占有絕對優勢，且這2種優勢種總的比例在種植植物區整體略高于無植物區，而擬桿菌門和綠彎菌門在植物區均是A50>A20，在無植物區沒有明顯差異。