浙江部分地區(qū)豬源鏈球菌的分離鑒定

曲業(yè)鵬，馮富，馬有智

(浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌引起的人畜共患病，具有較高的流行性[1]。豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是該病最主要的病原菌，馬鏈球菌獸疫亞種、糞腸球菌、屎腸球菌、類豬鏈球菌等也易引發(fā)該病[2]。患豬鏈球菌病病豬臨床表現(xiàn)主要有腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥等[3]。在我國，隨著現(xiàn)代集約化豬場規(guī)模的不斷擴大，豬鏈球菌病發(fā)病率持續(xù)升高，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展[4]。

近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對豬源鏈球菌生物學(xué)特性研究的不斷深入和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于細菌的鑒定。本研究對2016—2018年浙江部分地區(qū)部分規(guī)模化豬場采集到的病料樣品進行豬源鏈球菌的分離鑒定工作，旨在了解浙江地區(qū)鏈球菌的分布情況，從而為預(yù)防治療豬鏈球菌病提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來源自2016—2018年浙江杭州、金華、舟山、義烏和紹興等地區(qū)規(guī)模化豬場的病死豬病料樣品；腦心浸出液肉湯(BHI)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自北京陸橋公司；標(biāo)準(zhǔn)小牛血清購自上海聯(lián)碩公司；綿羊血購自浙江金華利民試劑經(jīng)營部；DL2000 DNA Marker與2×TaqPCR Mastermix購自TaKaRa公司；引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

1.2 細菌分離培養(yǎng)

綿羊血平板制備：稱取19 g TSA置于錐形瓶中，加入500 mL蒸餾水，水浴加熱使TSA完全溶解，高壓滅菌后將錐形瓶置于超凈工作臺冷卻至55 ℃左右，加入25 mL綿羊血，期間不斷振蕩錐形瓶使綿羊血與TSA充分混勻，然后將其倒入一次性培養(yǎng)皿中(每個20 mL)，待培養(yǎng)基冷卻凝固后放入4 ℃冰箱備用。

挑選病豬的肺臟、脾臟、肝臟、腎臟和淋巴結(jié)，用經(jīng)酒精燈燒過的接種環(huán)蘸取臟器的病變部位，并畫線接種到血平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。無菌挑取單菌落劃線接種到血平板上純化，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

通過革蘭染色鏡檢與觸酶試驗，初步鑒定出疑似鏈球菌菌株。

1.3 DNA模板制備

分別挑取疑似鏈球菌菌株的單菌落接種到BHI液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)中37 ℃過夜培養(yǎng)，取1 mL菌液于離心管中，12 000 r·min-1離心1 min，棄去上清液，加入100 μL雙蒸水，置于沸水中11 min，再將其置于冰水混合物中6 min，再次離心，取上清液。

1.4 豬源鏈球菌檢測

初步判定革蘭染色陽性、觸酶試驗陰性的鏈狀球菌為疑似鏈球菌，采用鏈球菌屬16SrRNA引物對疑似鏈球菌菌株進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括：2×TaqPCR Mastermix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，用雙蒸水調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 豬鏈球菌及其分型檢測

采用豬鏈球菌16SrRNA引物對鑒定為鏈球菌的菌株進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系同1.4，退火溫度為60 ℃，其他反應(yīng)條件參照1.4，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用豬鏈球菌CPS1、CPS2、CPS5、CPS7、CPS8、CPS9和CPS29引物分別對豬鏈球菌進行PCR分型檢測。PCR反應(yīng)體系同1.4，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 非豬鏈球菌檢測

使用VITEK 2 Compact全自動細菌分析系統(tǒng)對非豬鏈球菌進行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬源鏈球菌分離培養(yǎng)

從2016—2018年浙江地區(qū)規(guī)模化豬場送檢的病死豬病料中共分離到55株疑似豬源鏈球菌。通過染色鏡檢可發(fā)現(xiàn)疑似鏈球菌呈革蘭氏陽性，菌體為球形或橢圓形，單在、成對或鏈狀排列，在血平板上形成灰白色、光滑、圓形突起的小菌落，α溶血、β溶血和不溶血的現(xiàn)象均有出現(xiàn)。

2.2 豬源鏈球菌鑒定

55株疑似鏈球菌的PCR結(jié)果顯示，有51株為豬源鏈球菌，均有207 bp目的條帶。豬源鏈球菌中，有25株豬鏈球菌和26株非豬鏈球菌，檢出率分別為49.02%(25/51)和50.98%(26/51)。

2.3 豬鏈球菌及其分型鑒定

25株豬鏈球菌PCR分型檢測結(jié)果顯示：1、2、7、8、9和29型SS分別在637、498、379、268、388、263 bp處有目的條帶。結(jié)果見圖1。其中2型菌株分離率最高，為48%(12/25)；8型菌株分離率次之，為16%(4/25)；9型菌株分離率為12%(3/25)；7型菌株分離率為8%(2/25)；1型和29型菌株分離率最低，均為4%(1/25)；未定型菌株占8%(2/25)。詳見表2。

表2 豬鏈球菌分型鑒定

2.4 非豬鏈球菌鑒定

經(jīng)VITEK微生物鑒定系統(tǒng)分析，26株非豬鏈球菌中，乳房鏈球菌、糞腸球菌、淺綠色氣球菌和屎腸球菌各分離到3株，分離率均為11.54%(3/26)；毗鄰鏈球菌分離率為7.69%(2/26)；停乳鏈球菌馬樣亞種、血鏈球菌、偽豕鏈球菌、豬腸鏈球菌、盲腸腸球菌、乳酸片球菌、耳炎差異球菌各分離到1株，分離率均為3.85%(1/26)；未確定到種的鏈球菌有5株，占19.23%(5/26)。詳見表3。

表3 非豬鏈球菌分離鑒定結(jié)果

3 討論

本研究對2016—2018年浙江地區(qū)規(guī)模化豬場病料樣品進行了分離鑒定，結(jié)果表明，51株豬源鏈球菌中SS分離率為49.02%，SS中1、2、7和9型分離率分別為4%、48%、8%和12%。趙戰(zhàn)勤等[4]對河南省及鄰近省份在2011—2015年分離到的310株豬源鏈球菌進行鑒定，結(jié)果顯示，SS有135株，分離率是43.55%，其中2型菌株的分離率達到53.3%，7型為10.4%，9型為10.4%，1型為1.5%，其他血清型占24.4%。Wei等[8]對中國16個省(市)患豬鏈球菌病的臨床樣本進行細菌分離鑒定，共得到719株鏈球菌，有407株SS，分離率是56.61%，其中2型分離率最高(43.2%)，7型和9型的分離率分別為3.7%和1.2%。本試驗中，豬源鏈球菌的檢出率與各型SS的檢出率與上述報道基本一致。

本試驗還分離到4株8型SS和1株29型SS，分離率分別為16%和4%，8型SS的分離率僅次于2型菌株，而陳雯雯等[7]對2017年廣西地區(qū)SS分離菌株進行分型鑒定發(fā)現(xiàn)，5、8、29型SS的檢出率分別為6.25%、31.25%和6.25%。盡管本試驗中8型SS的檢出率低于陳雯雯等報道的數(shù)據(jù)，但足以說明浙江地區(qū)存在8型SS，且有一定的流行趨勢。

本次試驗中，51株豬源鏈球菌中有26株非豬鏈球菌，分離率為50.98%，其中乳房鏈球菌、糞腸球菌、淺綠色氣球菌和屎腸球菌均占11.54%，毗鄰鏈球菌分離率為7.69%，停乳鏈球菌馬樣亞種、血鏈球菌、偽豕鏈球菌、豬腸鏈球菌和盲腸腸球菌等各占3.85%。賀名葉等[9]對湖南地區(qū)一些病死豬樣本病原菌的鑒定結(jié)果顯示：36株豬源鏈球菌中，除SS外另有12株種類不同的鏈球菌，分離率達到33.33%，其中淺綠氣球菌占25.0%，馬鏈球菌獸疫亞種、糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎鏈球菌和停乳鏈球菌等各占8.33%。雖然本次試驗中各鏈球菌屬菌株的分離率與上述報道有差異，但也說明多種鏈球菌可引發(fā)豬鏈球菌病。腸球菌屬原屬于D群鏈球菌屬成員，與鏈球菌屬非常相似，分離鑒定時容易被誤判為鏈球菌。