凝膠滲透色譜聯用多角度激光光散射測定鐵皮石斛多糖分子量及其分布

胡衛珍，齊振宇，陳曉芳，張嫻

(浙江大學 農業試驗站，浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛作為我國名貴中藥，列中華九大仙草之首，具有滋養陰津、清熱生津、益智安神、強精壯骨之功效[1]。鐵皮石斛多糖是鐵皮石斛的主要活性成分，具有抗癌、調節免疫、抗氧化等作用[2-3]。對于多糖類產品，分子質量是研究其性質、結構特征的基礎，更是考察其質量是否穩定的重要指標之一，而且不同分子質量的多糖，活性差異也較大，因此，測定多糖的分子質量具有重要意義。

凝膠滲透色譜-多角度激光散射是用于測定聚合物、多糖、蛋白質、核酸等生物大分子絕對分子質量的新技術，無需標準物質校正，可同時獲得樣品分子質量分布和樣品構象信息。它以快速、高效、穩定等特點被世界衛生組織(WHO)推薦納入多糖質控體系[4-5]，但目前用此項技術測定鐵皮石斛多糖分子質量及其分布的研究報道較少。本文以自制的鐵皮石斛多糖為研究對象，建立了凝膠滲透色譜-多角度激光光散射聯用技術測定鐵皮石斛多糖分子質量及其分布的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安捷倫1260 Infinity II液相色譜儀(安捷倫科技公司)，DAWN HELEOS II多角度激光光散射儀、Optilab rEX示差、DynaPro NanoStar 動態激光光散射儀(美國懷雅特公司)，超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設備有限公司)，AUW220D電子天平(日本島津)，DK-8D電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，凝膠柱Shodex OHpak SB-806 HQ, Shodex OHpak SB-805 HQ(日本昭和電工株式會社)。實驗材料為本實驗室制備的不同種源地鐵皮石斛凍干多糖樣品(分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示)，其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

凝膠柱：Shodex OHpak SB-806 HQ、Shodex OHpak SB-805 HQ串聯；流動相：含0.02% NaN3的0.15 mol·L-1的氯化鈉溶液(0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣)；流速：0.5 mL·min-1；MALLS檢測儀，RID檢測儀，進樣量25 μL，柱溫25 ℃[6-7]。

1.3 供試品溶液制備

精密稱取鐵皮石斛凍干多糖樣品，用流動相配成3 mg·mL-1的溶液，待樣品完全溶解后用0.22 μm濾膜過濾。過濾后濾液用高效凝膠滲透色譜聯用多角度激光散射和示差折光儀(HPSEC-MALLS-RID)進行分析，采用Astra6軟件收集和處理數據。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

采用不同濃度的樣品進行實驗，結果表明，濃度高的樣品容易造成凝膠柱和檢測器的污染；而且多糖分子質量較大，一般溶解度較小，濃度過高，易溶解不完全，從而造成較大實驗誤差。相對濃度低的樣品會在凝膠柱上得到完全的洗脫和分離。因此，本實驗選擇樣品的濃度為3 mg·mL-1。

比較流動相超聲脫氣處理前后的測定情況發現，流動相內溶解的氧氣進入流路后，一方面影響了流量的穩定性，另一方面會在色譜圖上出現尖銳的峰，從而影響了實驗結果的準確性。故本實驗流動相需要超聲脫氣處理。

2.2 HPSEC-MALLS-RID分析

采用HPSEC-MALLS-RID聯用技術對供試的鐵皮石斛多糖樣品進行測定，其色譜圖見圖1。從圖1可看出，鐵皮石斛多糖樣品在MALLS和示差檢測器上給出的色譜圖有明顯差異。兩者的出峰時間不一樣，出現明顯的延遲；激光信號只呈現一個窄分布的色譜峰，而示差信號還呈現2個小的色譜峰，主要是由于激光信號強弱與樣品濃度、相對分子質量有直接關系，對于分子尺寸較小的樣品來說，如果濃度太低，散射光強度就較弱，與之對應的激光信號也較弱。而示差折光檢測器的信號只與分子濃度有關，示差圖上后面的峰是由于樣品中的小分子聚糖造成的。所以絕對分子質量測定需要來自激光光散射檢測器和示差折光檢測器的信號。從測定結果可知，鐵皮石斛多糖樣品的數均分子質量(Mn)為2.903×105u，峰位分子質量(Mp)為3.406×105u，重均分子質量(Mw)為3.741×105u，Z均分子質量(Mz)為5.033×105u，多分散系數(Mw/Mn)為1.289，說明其均一性良好。

A—多角度激光光散射檢測；B—示差檢測。

2.3 不同種源地多糖分子質量及其分布差異

將3個不同種源地的鐵皮石斛多糖樣品，按照1.3節方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件測定其分子質量與分子質量分布，采用Astra6軟件進行數據分析，結果見表1。不同種源地鐵皮石斛多糖分子質量及分布有差異，種源Ⅰ的鐵皮石斛多糖重均分子質量(Mw)最大，為3.741×105u。多分散系數(Mw/Mn)反映高分子化合物的分子質量分散水平。3個種源的鐵皮石斛多糖多分散系數介于1.289～1.502，均具有較窄的分子質量分布，但種源Ⅰ多糖分子均一性相對較好。旋轉半徑反映該分子的松散程度，旋轉半徑越小說明樣品的形態越緊致。從表1可以看出，這3個種源的多糖樣品旋轉半徑相似，都在60 nm左右。但旋轉半徑與重均分子質量的大小順序不一致，這是由于在鹽溶液中樣品分子形狀發生皺縮，引起分子大小降低造成的。

3 小結

HPSEC-MALLS是近年來國際通用的多糖分子質量分析方法。本文采用凝膠滲透色譜-多角度激光散射聯用技術對鐵皮石斛多糖的分子質量進行了測定，并對不同種源間多糖分子質量及其分布進行了分析比較。結果表明，不同種源地鐵皮石斛多糖分子質量及分布有差異。HPSEC-MALLS在鐵皮石斛多糖組分分析中具有很好的應用前景，可為鐵皮石斛種源優選、質量評價提供參考。