延胡索葉不同發(fā)育期總生物堿含量測(cè)定

趙永欽，成余勤，岑巧夢(mèng)，邵敬寶，馬美蘭，石森林*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053； 2.東陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所，浙江 東陽(yáng) 322100)

延胡索為罌粟科植物延胡索(Corydalisyanhusuo)的干燥塊莖。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有兩千多年的應(yīng)用歷史，主要用于胸痹心痛、脘腹疼痛、腰痛、疝氣痛、痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后瘀滯腹痛、跌打損傷等治療[1]，為中藥復(fù)方制劑中的常用藥。延胡索原主產(chǎn)于浙江，引種至陜西漢中至今約有40年歷史，到目前已發(fā)展成為延胡索主產(chǎn)區(qū)之一[2]。研究表明，延胡索地上部分的藥效成分和地下莖的差別很大，主要為阿樸啡型生物堿，如O-甲基南天竹堿、海罌粟堿、1-甲基乙基-3，4，6，7-四甲氧基菲、去甲海罌粟堿和β-谷甾醇[3]。O-甲基南天竹堿具有抑制中樞神經(jīng)[4]、止咳平喘[5]、麻痹[6]的作用；海罌粟堿及去甲海罌粟堿具有抗炎鎮(zhèn)痛[7-9]、擴(kuò)張支氣管[10]、抗腎上腺素[11]、阻斷鈣離子通道活性[12]的作用；β-谷甾醇具有降膽固醇[13-14]、抑制腫瘤[15-16]和修復(fù)胃粘膜[17]的作用；1-甲基乙基-3，4，6，7-四甲氧基菲其具體藥理作用研究較少。目前針對(duì)延胡索塊莖生物堿指紋圖譜、提取純化工藝以及藥理活性研究文獻(xiàn)報(bào)道較多[18-21]，關(guān)于葉總生物堿的研究只有零星報(bào)道[22]。延胡索塊莖生物堿與葉生物堿均為異喹啉生物堿，可能具有與塊莖生物堿相似的活性。在延胡索栽培過(guò)程中，延胡索葉一般以農(nóng)業(yè)廢棄物處理，既造成資源浪費(fèi)，也加大了環(huán)保壓力。隨著對(duì)傳統(tǒng)非藥用部位資源化學(xué)成分的深入研究，部分傳統(tǒng)非藥用部位的潛在資源價(jià)值逐漸顯現(xiàn)，并越來(lái)越引起人們的高度重視。已有研究表明，延胡索地上部分生物堿成分均為阿樸啡型，與地下塊莖差別較大，可能具有與塊莖不同的藥理活性。關(guān)于不同生育期延胡索葉總生物堿變化的研究鮮見報(bào)道。本研究在建立了紫外分光光度法測(cè)定延胡索葉總生物堿含量方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析兩年間不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期延胡索葉的次生代謝產(chǎn)物動(dòng)態(tài)積累規(guī)律，研究浙江道地藥材延胡索葉不同生長(zhǎng)發(fā)育期生物堿類次生代謝產(chǎn)物積累規(guī)律，確定最佳采收期，為道地產(chǎn)區(qū)延胡索葉GAP種植、質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

延胡索葉于2017—2019年采自浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院“浙八味”研究所試驗(yàn)田，經(jīng)石森林教授鑒定為罌粟科植物延胡索(Corydalisyanhusuo)的干燥葉片，洗凈、殺青、烘干備用。鑒于延胡索葉的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律和生物量，采樣分以下5個(gè)時(shí)期進(jìn)行：葉盛發(fā)期(3月16日)、開花初期(3月23日)、開花盛期(3月31日)、開花末期(4月8日)、葉衰老期(4月16日)。

1.2 試劑

延胡索乙素對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，含量99.86%，批號(hào)MUST-18032720)；無(wú)水乙酸鈉(批號(hào)20160315)、無(wú)水硫酸鈉(批號(hào)2016092901，成都科龍化工試劑廠)；溴甲酚綠(批號(hào)20160817，廣東精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心)；氯仿分析純(成都科龍化工試劑廠)；甲醇為色譜純(美國(guó)Tedia公司)；其他試劑均為分析純(成都科龍化工試劑廠)。

1.3 試驗(yàn)儀器

UV-Vis 2450型紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)；DFY-500高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；XS105 DualRange型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；JA2003N電子天平(上海精密儀器有限公司)；MAS-Ⅱ Plus型常壓微波提取器(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；FE20 pH計(jì)(瑞士梅特勒-托利多公司)；Millipore Synergy超純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)。

1.4 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備。精密稱取延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，即得187.60 μg·mL-1的延胡索乙素對(duì)照溶液。

供試品溶液的制備。精密稱取0.500 g延胡索葉粉末，測(cè)定含水量后，置于100 mL的微波提取器中，加入50 mL pH為3.0的醋酸鹽緩沖液，在70 ℃ 350 W的微波條件下提取20 min，冷卻后進(jìn)行抽濾，精密移取10 mL的續(xù)濾液，用濃氨水調(diào)節(jié)pH至8.0，等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于蒸發(fā)皿中，在80 ℃條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，即得供試品溶液。

1.5 顯色方法和測(cè)定波長(zhǎng)選擇

1.5.1 顯色試驗(yàn)

依次在分液漏斗中加入12 mL pH為4.5的緩沖液，3 mL溴甲酚綠溶液，1 mL樣品及9 mL氯仿，振蕩均勻，靜置半小時(shí)后，將氯仿層放于盛有0.4 g無(wú)水硫酸鈉的10 mL離心管中。

1.5.2 波長(zhǎng)選擇

取顯色后的延胡索乙素對(duì)照品溶液與供試品溶液，以氯仿為空白參比溶液，在200～600 nm波長(zhǎng)掃描，在411 nm處標(biāo)準(zhǔn)品與供試品均具有最大吸收峰，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為411 nm。

1.6 延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取1.4節(jié)中配制的對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，進(jìn)行顯色試驗(yàn)，在411 nm處測(cè)定吸光度；以延胡索乙素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.005 2X-0.019 09(R2=0.999 8，n=6)。結(jié)果表明，延胡索乙素在18.760～187.600 μg·mL-1范圍內(nèi)吸光度與濃度的線性良好。

1.7 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)

取1.4節(jié)中配制的對(duì)照品溶液，進(jìn)行顯色試驗(yàn)后，在同一條件下連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.12%，表明方法精密度良好。

1.4節(jié)中配制的對(duì)照品溶液進(jìn)行顯色試驗(yàn)，在411 nm波長(zhǎng)處每隔20 min測(cè)定1次吸光度，連續(xù)測(cè)定6 h，測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.3%，表明顯色后的延胡索乙素在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

按1.4節(jié)方法處理供試品，平行制備6份，進(jìn)行顯色試驗(yàn)，在411 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.90%。結(jié)果表明，試驗(yàn)的重復(fù)性良好。

1.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱定9份延胡索葉片粉末0.25 g，分別置于100 mL的微波提取器中，分別加入樣品總堿含量的80%、100%、120%延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液，顯色后，在411 nm處測(cè)定吸光度。

1.9 不同發(fā)育期延胡索葉生物堿含量測(cè)定

精密稱取不同發(fā)育期的延胡索葉片粉末0.5 g，平行3份，測(cè)定含水量，置于100 ml的微波提取器中，按1.4節(jié)方法制備供試品溶液，在411 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算總生物堿含量，試驗(yàn)處理及數(shù)據(jù)測(cè)定均重復(fù)3次，取其平均值，方差分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 回收率

表1顯示，平均加樣回收率為99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為3.0%，表明加樣回收率良好。

2.2 不同發(fā)育期延胡索葉生物堿含量

表2顯示，延胡索葉總生物堿連續(xù)2年含量動(dòng)態(tài)變化呈整體下降趨勢(shì)，即從葉盛發(fā)期到葉衰老期，總生物堿含量逐漸降低，尤其初花期到盛花期下降顯著。

表1 樣品的回收情況

表2 不同發(fā)育期延胡索葉總生物堿含量變化

3 討論

隨著對(duì)傳統(tǒng)非藥用部位資源化學(xué)成分的深入研究，部分傳統(tǒng)非藥用部位的潛在資源價(jià)值逐漸顯現(xiàn)，并越來(lái)越引起人們的高度重視，如銀杏葉、杜仲葉等逐漸演化為藥用，成為中藥體系中的新增品種。人參莖葉、花、果序等均含有與人參相似的資源性化學(xué)成分，具有較高的藥用及保健價(jià)值。開發(fā)利用使人參各組織部位的資源價(jià)值得到充分釋放，人參資源經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)鏈得到有效延伸。黃芩莖葉、地黃莖葉均已開發(fā)形成成藥，并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[23-24]。研究顯示，在延胡索葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，某些時(shí)期總生物堿含量可達(dá)20 mg·g-1以上，幾乎與延胡索塊莖生物堿含量相當(dāng)，這為延胡索葉開發(fā)入藥提供了物質(zhì)保證。

中藥材有效成分多為次生代謝產(chǎn)物，不僅與植物所處的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期有關(guān)，而且是與環(huán)境相互作用的產(chǎn)物，在植物提高自我保護(hù)和生存競(jìng)爭(zhēng)能力、協(xié)調(diào)與環(huán)境關(guān)系上充當(dāng)著重要角色，其產(chǎn)生和變化比初生代謝產(chǎn)物與環(huán)境有著更強(qiáng)的相關(guān)性[25]。由于延胡索是多年生的草本植物，各生育階段是連續(xù)不斷且相互重疊的。可將延胡索的生長(zhǎng)發(fā)育階段簡(jiǎn)單分為塊莖萌芽期、葉初發(fā)期、葉盛發(fā)期、開花初期、開花盛期、開花末期、葉衰老期、塊莖休眠期八個(gè)時(shí)期，考慮后期資源開發(fā)利用，本研究只對(duì)中間幾個(gè)關(guān)鍵時(shí)期葉總生物堿含量進(jìn)行了含量測(cè)定，至于不同時(shí)期總生物堿成分的差異仍需進(jìn)一步研究。

生物堿是植物長(zhǎng)期生態(tài)環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物。由于次生代謝產(chǎn)物含量只有在初級(jí)代謝中間產(chǎn)物積累到一定程度并在調(diào)節(jié)次生代謝的酶促作用下才會(huì)出現(xiàn)高峰[26]。葉盛發(fā)期、開花初期這2個(gè)時(shí)期由于光照充足，雨量充沛，光合作用的速率較高，因此，延胡索生長(zhǎng)迅速，代謝旺盛。此時(shí)也容易遭受食草動(dòng)物、微生物侵害，所以生物堿等次生代謝產(chǎn)物需要維持較高水平。延胡索作為夏季休眠的多年生植物，生長(zhǎng)進(jìn)入盛花期后期，光照強(qiáng)度增加和日照時(shí)間延長(zhǎng)，地下塊莖快速膨大，體內(nèi)累積的物質(zhì)開始分解、轉(zhuǎn)化，葉片中生物堿等次生代謝產(chǎn)物含量不斷降低轉(zhuǎn)移至塊莖中。本研究表明，延胡索葉片總生物堿含量隨植株的生長(zhǎng)發(fā)育而波動(dòng)，而浙江傳統(tǒng)采收期(5月上旬)的生物堿含量最低。因此，針對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育期延胡索的次生代謝產(chǎn)物積累變化的研究是必要的。