腦源性神經營養因子對人冠狀動脈內皮細胞增殖和克隆的影響

孔繼昌 王恩艷 張巍 戴坤鵬 劉少云 付永杰 郭志強

近年來，老年人群中CHD、腦血管意外等心腦血管疾病發病率越來越高，已經成為威脅人類健康最嚴重的疾病之一，其中動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）被認為是心腦血管疾病重要的病理基礎和直接誘因［1］。AS 能夠廣泛侵襲全身血管，造成器官損傷，引起多種疾病的發生。血管內皮細胞作為機體重要的代謝和內分泌器官，其結構及細胞功能受損在心血管疾病的發生發展中起重要作用。多篇文獻報道，腦源性生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）參與調節多種內皮細胞的生長及分化，作為一種新的促血管新生因子，其能夠促進人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的血管新生［2］。最近有研究發現，在T2DM 合并頸動脈粥樣硬化病人的血清中，BDNF水平降低，暗示血清低水平的BDNF 可能參與頸動脈粥樣硬化的發生及發展［3］。因此，本研究以人冠狀動脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC）為實驗對象，探討BDNF對HCAEC功能的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HCAEC 系購自中科院上海細胞庫；重組人源BDNF 蛋白購自ProSpec 公司；RPMI-1640 培養液購自HYCLONE 公司；胎牛血清、雙抗和0.25%胰酶消化液購自Gibco 公司；細胞計數試劑盒（cell counting Kit-8，CCK8）購自北京索萊寶公司；兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（Phospho-Akt，p-Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、磷酸化mTOR（Phospho-mTOR，p-mTOR）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（Phospho-ERK1/2，p-ERK1/2）、Wnt 蛋白家族1（Wnt family member 1，Wnt1）、跨膜受體卷曲蛋白1（Frizzled1）、胞漿調節散亂蛋白1（dishevelled segment polarity protein 1 pseudogene 1，Dsh）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的抗兔IgG 抗體均購自Abcam 公司；細胞培養耗材均購自美國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組處理：HCAEC 置于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（0.1 mg/mL）的RPMI-1640培養液中，于37℃的5%CO2培養箱中培養24 h。取生長狀態良好，處于對數生長期的細胞進行實驗。細胞分為2 組，實驗組加BDNF（50 ng/μL），對照組不做其他處理。

1.2.2 CCK8增殖實驗：2組細胞培養24 h后，消化細胞，制備細胞懸液并計數，取100μL細胞懸液，以每孔1×103個/mL 細胞的標準接種到96 孔板中，每隔24 h檢測1 次細胞活力，共檢測4 次，檢測前每孔加10μL CCK8 試劑，37℃培養箱中孵育1 h，使用酶標儀用450 nm激發光檢測OD值，繪制增殖曲線。

1.2.3 平板單克隆形成實驗：2 組細胞培養24 h 后，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞10 min，用RPMI-1640培養液終止消化，制備細胞懸液，按照2×103個/mL 細胞數接種到100 mm 培養皿中，實驗組加入含BDNF（50 ng/μL）的RPMI-1640 培養液，對照組加入等量的RPMI-1640培養液培養，3 d后更換培養液，再培養2 d，4%甲醛固定10 min，結晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察、拍照、計數。計數方法為：顯微鏡下任意選取5 個視野，統計單克隆數目，取5 個視野的平均數為最后結果。

1.2.4 免疫印跡（Western blot）實驗檢測信號通路相關蛋白表達水平：2 組細胞培養24 h 后，加RIPA 裂解液（使用前加入蛋白酶抑制劑）裂解提取蛋白，取適量蛋白液適度稀釋，通過BCA 法測定濃度，剩余蛋白液加入LDS sample buffer 煮沸5 min。配制10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠，20μg/孔加入蛋白樣品，轉膜至硝化纖維素膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，快速沖洗掉一抗，TBST 緩沖液洗3 次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗3 次，每次5 min，加ECL 顯色。實驗獨立重復3 次。采用Image J 分析所得圖像，以目的蛋白/GAPDH灰度比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較均采用獨立樣本t檢驗或LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組HCAEC 增值能力比較 CCK8 實驗結果顯示，培養24 h 后，2 組細胞OD 值比較差異無統計學意義（P＞0.05）；培養48、72 h后，與對照組相比，實驗組的細胞OD值均顯著增加（P均＜0.05）。見表1。

表1 2組細胞增殖能力比較（±s，n=3）

表1 2組細胞增殖能力比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

72 h 0.8043±0.0573 1.1389±0.0747**組別對照組實驗組0 h 0.2440±0.0415 0.2470±0.0101 24 h 0.3800±0.0330 0.4521±0.0441 48 h 0.5520±0.0671 0.7134±0.0638*

2.2 2組HCAEC 克隆形成能力比較 單克隆平板形成實驗結果顯示，培養5 d后，實驗組的細胞克隆形成數目為（228±13）個，與對照組相比［（85±7）個］，差異有統計學意義（t=16.776，P＜0.05）。

2.3 2 組PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白表達水平比較 Western blot 結果表明，與對照組相比，實驗組細胞中的PI3K/Akt/mTOR 信號通路關鍵組分Akt 和mTOR 蛋白表達水平差異無統計學意義（P均＞0.05），但p-Akt、p-mTOR 水平較對照組顯著增加（P均＜0.05）見表2。

表2 PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達水平（±s，n=3）

表2 PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達水平（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

p-mTOR 0.413±0.069 0.584±0.059*組別對照組實驗組Akt 0.767±0.082 0.704±0.043 p-Akt 0.469±0.046 0.903±0.075**mTOR 0.734±0.059 0.769±0.069

2.4 2 組ERK 信號通路蛋白表達水平比較 Western blot 結果表明，2 組細胞中的ERK 信號通路關鍵組分ERK1/2 蛋白表達水平差異無統計學意義［（0.609±0.032）比（0.587±0.044），t=0.7179，P=0.5125］；而實驗組p-ERK1/2 表達水平較對照組顯著升高［（0.377±0.022）比（0.547±0.051），t= 5.3766，P=0.0058］。

2.5 2 組Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達水平比較 Western blot 結果表明，與對照組相比，實驗組Wnt/β-catenin 信 號 通 路 相 關 蛋 白Wnt1、Frizzled1 和Dsh的蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.01）。見表3。

表3 2組Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達水平比較（±s，n=3）

表3 2組Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達水平比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，**P ＜0.01

Dsh 0.339±0.043 0.690±0.041**組別對照組BDNF組Wnt1 0.086±0.060 0.364±0.053**Frizzled1 0.701±0.029 1.125±0.081**

3 討論

研究表明，BDNF在神經細胞的生長發育、分化和再生、損傷修復等過程中發揮關鍵作用［4-5］。Guan等［6］研究發現，BDNF 在腦出血后表達上調，能夠促進神經再生和血管生成。目前，BDNF 已經表現出了對PD［7］、AD［8］等神經系統疾病的治療潛力。另有研究表明，BDNF 在HUVECs 和人腦血管內皮細胞等多種內皮細胞以及新生血管平滑肌細胞中表達，參與維持血管內皮細胞的存活［9］，促進血管內皮細胞的增殖、遷移并抑制細胞衰老和凋亡，促進血管新生［10］。但目前尚無BDNF 對HCAEC 功能的影響及其作用機制的相關報道。本研究發現，外源添加BDNF 處理可明顯促進HCAEC 的增殖和克隆能力，與在HUVECs 中發揮的功能類似。然而，BDNF 調節HCAEC 增殖和克隆能力的具體分子機制和所涉及的信號轉導通路還尚未清楚。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路是生物體內關鍵的信號通路，參與調控細胞增殖、存活和凋亡等生理活動［11］。在HUVECs 中，BDNF 就是通過PI3K/Akt 信號傳導通路促進HUVECs 的體外遷移和存活［2］。本研究發現，BDNF 處理增加了Akt 和m-TOR 蛋白的磷酸化水平，促進了PI3K/Akt/mTOR 信號通路的活化，提示PI3K/Akt/mTOR 信號通路可能參與了BDNF誘導的HCAEC增殖和克隆。ERK1/2是一個能夠介導血管新生的重要的信號蛋白，在HUVECs 中，ERK1/2 被BDNF 誘導磷酸化，參與了HUVECs 細胞增殖［2］。本研究發現，BDNF 處理同樣增加了HCAEC 中ERK1/2蛋白的磷酸化水平，因此，ERK 信號通路也可能參與了BDNF促進HCAEC增殖的過程。

Wnt/β-catenin 信號通路也是一條生物發育、細胞增殖和凋亡等生理活動的關鍵信號通路。研究發現，Wnt/β-catenin 信號通路參與了BDNF 誘導神經元細胞及神經元干細胞生長的過程［12-13］。因此，本研究分析了HCAEC 中BDNF與Wnt/β-catenin信號通路的關系。結果表明，BDNF 處理組細胞中的Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白Wnt1、Frizzled1 和Dsh 的表達水平升高，提示Wnt/β-catenin 信號通路可能也參與了BNDF誘導的HCAEC 增殖和克隆過程。那PI3K/Akt/mTOR信號通路、ERK 信號通路和Wnt/β-catenin 信號通路具體是如何參與BDNF 對HCAEC 增殖和克隆的誘導過程的呢？這三條信號通路是否有相互聯系？這將是我們下一步深入研究的重點。

綜上所述，本研究發現BDNF 能夠誘導HCAEC的增殖和克隆，可能通過調節PI3K/Akt/mTOR 信號通路、ERK 信號通路和Wnt/β-catenin 信號通路發揮作用。本研究揭示了BDNF 在HCAEC 生長過程中具有重要意義，為將來BDNF在AS臨床治療中的應用提供了參考。