燈臺(tái)葉堿調(diào)節(jié)放射性肺炎細(xì)胞及大鼠血清細(xì)胞因子水平的實(shí)驗(yàn)研究

劉珊， 蔣永新， 王洋， 張靖熙， 劉馨元， 唐琴，王思毓， 夏玉海， 劉艷艷， 沈紅梅

昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，云南 昆明 650118

放射性肺損傷(Radiation-induced lung injury，RILI)是胸部惡性腫瘤(肺癌、食管癌、乳腺癌、縱膈內(nèi)惡性腫瘤)在接受放射性治療過程中正常肺組織不可避免的受到一定劑量的射線照射而造成的肺損傷[1]。放射性肺損傷作為臨床上常見的放療并發(fā)癥，影響著腫瘤靶區(qū)劑量以及全局放療的療效，是放療療效最大程度發(fā)揮的主要制約因素。據(jù)國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道，放射性肺炎發(fā)生率約為29.6%～50.3%[2-4]。臨床上主要是通過調(diào)整放療方案、放療總劑量以及放療單次劑量等來預(yù)防、減少放射性肺炎的發(fā)生；并應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、抗生素加強(qiáng)抗感染、輔助以非甾體藥物以及運(yùn)用中醫(yī)中藥來治療已產(chǎn)生的放射性肺炎。然而，現(xiàn)有的治療方法只能暫時(shí)性緩解癥狀，遠(yuǎn)期療效欠佳[5]，亟需尋求安全性好、療效佳的治療方案。燈臺(tái)葉為云南特色天然民族藥，其粗提物制劑“燈臺(tái)葉顆粒”和“燈臺(tái)葉片”已上市使用多年，其安全性和有效性均得到臨床驗(yàn)證，在臨床上主要用于慢性支氣管炎、百日咳等呼吸系統(tǒng)疾病的治療。本研究建立放射性肺炎細(xì)胞及大鼠動(dòng)物模型，探索燈臺(tái)葉堿對(duì)放射性肺炎的治療療效及其機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 材料

BEAS-2B支氣管肺泡上皮細(xì)胞，購自中科院昆明生物所細(xì)胞庫；雄性SD大鼠150只，SPF級(jí)，鼠齡6 w，質(zhì)量(300±10)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004；胎牛血清、RPMI-1640、PBS、青霉素和鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒購自Hyclone公司；燈臺(tái)葉堿，由中科院昆明植物所提供；流式細(xì)胞儀由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 放射性肺炎細(xì)胞模型的建立及血清樣本的采集

將BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，待細(xì)胞80%融合時(shí)根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)選擇4Gy 6Mv X-ray照射，照射24小時(shí)后換液，加入含有燈臺(tái)葉堿(C=90 μg/mL)的完全培養(yǎng)基。待燈臺(tái)葉堿作用24小時(shí)后吸取細(xì)胞液上清，4℃低溫離心機(jī)中離心1 000 g 5min，取上清液體；立即分裝，并將樣本置于-80℃中保存，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子

將標(biāo)準(zhǔn)品凍干微球用4mL稀釋液稀釋，將最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋；制備捕獲微球；制備檢測(cè)抗體；混勻Mixed Capture Beads；分別在各樣品管和標(biāo)準(zhǔn)品管中加入50 μL的Mixed Capture Beads；分別在各樣品管和標(biāo)準(zhǔn)品管中加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品：混勻，室溫避光孵育1 h；向各管中加入 50 μL Mixed PE Detection Reagent；混勻室溫孵育1 h：向各管中加入1μL Wash buffer，300 g離心5min；小心棄上清；各管加入300 μL Wash buffer重懸微球；上機(jī)分析，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α的水平。

1.2.3 放射性動(dòng)物模型的建立及分組

采用隨機(jī)數(shù)字法將150只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組25只，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)照射劑量選擇16Gy 6Mv X-ray照射大鼠全肺。

分組方式如下：(1)陰性對(duì)照組：不予放療，給予生理鹽水10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(2)單純放療組：放療同時(shí)給予生理鹽水10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(3)陽性對(duì)照組：放療同時(shí)給予地塞米松注射液2 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(4)燈臺(tái)葉堿低劑量組：放療同時(shí)給予燈臺(tái)葉堿10 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(5)燈臺(tái)葉堿中劑量組：放療同時(shí)給予燈臺(tái)葉堿20 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(6)燈臺(tái)葉堿高劑量組：放療同時(shí)給予燈臺(tái)葉堿40 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周。

1.2.4 大鼠血清樣本的采集及保存

在放射治療后第10天、第13天、第18天和第21天分別從各組選取5只SD大鼠進(jìn)行下腔靜脈取血，血清管收集，將全血樣品室溫靜置2小時(shí)，于4℃低溫離心機(jī)中離心1 000 g 15 min，取上清，將樣本分裝至-80℃中長期保存。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清中細(xì)胞因子

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣本孔，100 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測(cè)樣本溶液加入至每孔，輕晃，混勻，表面貼上板貼，避免溫育將液體過度蒸發(fā)，37℃溫箱溫育2 h。棄去液體，甩干，1 00 μL生物素標(biāo)記抗體工作液加入至每孔，表面重新貼上新板貼，37℃溫育1 h。棄去孔中的液體，干燥并洗滌板3次，每次浸泡2分鐘，200 μL/孔，甩干。100 μL HRP標(biāo)記親和素工作液加入至每孔，表面重新貼上新板貼，37℃溫育1 h。棄去孔中的液體，干燥并洗滌板5次。每次浸泡2分鐘，200 μl/孔，甩干。依次加，90 μL底物溶液至每孔中，37℃溫箱避光顯色15～30 min。依次每孔加50 μL終止溶液，使反應(yīng)終止。在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)，在酶標(biāo)儀上依次測(cè)量各孔450 nm波長處的吸光度(OD450)，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6的水平。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠血清中炎癥介質(zhì)

方法同1.2.2，檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α的水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈臺(tái)葉堿作用后，BEAS-2B細(xì)胞株細(xì)胞因子的變化

炎癥介質(zhì)分為促炎因子(IL-2、IL-6、TNF-α)與抗炎因子(IL-4、IL-6、IL-10)。細(xì)胞經(jīng)4Gy放射治療后，經(jīng)濃度為90 μg/mL的燈臺(tái)葉堿處理24 h后，促炎因子IL-2、TNF-α的細(xì)胞上清水平降低(P＜0.05)，抗炎因子IL-4和IL-10的細(xì)胞上清水平降低(P＜0.05)。同時(shí)作為抗炎和促炎因子的IL-6，其細(xì)胞上清水平在燈臺(tái)葉堿干預(yù)后未見明顯變化(見表1，圖1)。

表1 燈臺(tái)葉堿作用后BEAS-2B細(xì)胞株細(xì)胞因子的變化(±s)Table 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatmen(t±s)

表1 燈臺(tái)葉堿作用后BEAS-2B細(xì)胞株細(xì)胞因子的變化(±s)Table 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatmen(t±s)

*：P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

細(xì)胞因子IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-α P值0.0027*0.0063*0.6494 0.0074*0.0407*燈臺(tái)葉堿作用前(pg/ml)8.720±0.2417 10.60±0.2714 11.96±0.1808 2.590±0.2483 8.243±0.2050燈臺(tái)葉堿作用后(pg/ml)6.383±0.2571 8.863±0.1915 12.23±0.5197 1.263±0.8969 6.647±0.4948

圖1 燈臺(tái)葉堿作用后BEAS-2B細(xì)胞株細(xì)胞因子的變化Figure 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatment

2.2 燈臺(tái)葉堿作用后大鼠血清中細(xì)胞因子的變化

2.2.1 IL-2的變化

放療后地塞米松陽性對(duì)照組的IL-2的血清水平自放療后10日起維持低水平的狀態(tài)；放療后10日起，IL-2作為促炎因子，單純放療組其血清水平在短暫升高后呈持續(xù)下降趨勢(shì)，總體水平接近燈臺(tái)葉堿治療組，而高于陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組；低劑量組高于中劑量組，高劑量組介于二者之間(見圖2)。

2.2.2 IL-4的變化

IL-4是抗炎炎癥介質(zhì)，自放療后經(jīng)燈臺(tái)葉堿處理的第10日IL-4血清水平呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但上升程度無顯著燈臺(tái)葉堿劑量依賴性，陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和放療組自第10日起血清水平始終維持低水平狀態(tài)(見圖3)。

圖2 大鼠血清中細(xì)胞因子IL-2的變化Figure 2 Changes of cytokine IL-2 in rats serum

圖3 大鼠血清中細(xì)胞因子IL-4的變化Figure 3 Changes of cytokine IL-4 in rats serum

2.2.3 IL-6的變化

IL-6具有抗炎和促炎的雙重作用，燈臺(tái)葉堿作用下低劑量組和中低劑量組的IL-6血清水平逐漸下降，高劑量組IL-6的血清水平逐漸升高。陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組自第10日起血清水平始終維持低水平的波動(dòng)狀態(tài)，單純放療組始終維持高水平的波動(dòng)狀態(tài)(見圖4)。

2.3 TNF-α的變化

圖4 大鼠血清中細(xì)胞因子IL-6的變化Figure 4 Changes of cytokine IL-6 in rats serum

肺組織遭受電離輻射的損傷后，TNF-α的血清水平升高，隨著燈臺(tái)葉堿的作用，TNF-α血清含量逐漸下降，但TNF-α的下降程度無明顯的燈臺(tái)葉堿劑量依賴性；單純放療組TNF-α的血清水平始終處于高水平的波動(dòng)狀態(tài)；陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組TNF-α的血清水平在放療后第10天已處于低水平的狀態(tài)(見圖5)。

圖5 大鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α的變化Figure 5 Changes of cytokine TNF-α in rats serum

3 討論

放射治療是肺癌、乳腺癌、食道癌等胸部腫瘤患者的主要治療手段。肺是輻射中度敏感器官，放射治療可使腫瘤附近的肺組織因受到放射劑量超過其生物效應(yīng)的閾值而產(chǎn)生不同程度的損傷。一旦發(fā)生嚴(yán)重的放射性肺損傷，必將終止放射治療，轉(zhuǎn)而以大劑量口服糖皮質(zhì)激素控制炎癥為主。然而，糖皮質(zhì)激素帶來的副作用不容忽視，可能耽誤胸部腫瘤治療的最佳時(shí)機(jī)，加大腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，威脅患者生命[6，7]。因此，現(xiàn)有的治療放射性肺炎的方法僅能暫時(shí)緩解臨床癥狀，可導(dǎo)致全身多器官和系統(tǒng)的損傷，實(shí)際并未改善患者生活質(zhì)量。臨床迫切需要尋求一種安全有效的治療。在臨床及實(shí)驗(yàn)研究中，中藥預(yù)防和治療放射性肺炎受到越來越多的重視。

燈臺(tái)葉多產(chǎn)于云南、廣東等地，生于海拔650 m以下丘陵山地疏林中，為云南及兩廣等地少數(shù)民族用藥，性涼、味苦，能止咳祛痰、退熱消炎，屬被子植物門、夾竹桃科。曾收載于地方藥志，如《陸川本草》、《云南中草藥選》中，并為《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》(1974)和《中國藥典》(1977年版一部)所收載。傳統(tǒng)中藥燈臺(tái)葉堿獲取容易，價(jià)格低廉，是從燈臺(tái)葉中提取分離的有效成分，具有止咳平喘、清熱解毒的功效，用于急性氣管-支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作期(風(fēng)熱襲肺證)。燈臺(tái)葉對(duì)放射性肺炎是否有治療作用目前尚未見報(bào)道。

有研究發(fā)現(xiàn)放射性肺炎患者肺泡灌洗液中TNF-α分泌增加，但這種反應(yīng)在4個(gè)月內(nèi)達(dá)到平臺(tái)期，這表明，TNF可能在放射性肺炎的早期階段發(fā)揮作用[8]。本研究中TNF-α的變化與文獻(xiàn)報(bào)道一致，放療后血清中TNF-α水平上升，經(jīng)燈臺(tái)葉堿作用后下降，我們猜測(cè)燈臺(tái)葉堿可能在早期通過阻斷TNF與TNF受體的結(jié)合，從而阻斷下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)認(rèn)為早期放射性肺疾病的血清TNF敏感性高，TNF能夠促進(jìn)炎癥的進(jìn)展。

白細(xì)胞介素(ILs)衍生自肺巨噬細(xì)胞以及多種非巨噬細(xì)胞來源(例如，肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞等)。TNF-α和IL-2(早期炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子)的研究確立了這些介質(zhì)在肺血管粘附分子上調(diào)中的首要地位。IL-8細(xì)胞因子家族作用于白細(xì)胞上具有趨化和血管生成活性，能夠誘導(dǎo)膠原合成和細(xì)胞增殖[9]。本研究顯示：SD大鼠照射后血清IL-2、IL-6、TNF-α含量短期內(nèi)立即升高，提示IL-2、IL-6和TNF-α均作為抗炎介質(zhì)在放射性肺炎的早期發(fā)揮作用；燈臺(tái)葉堿干預(yù)后SD大鼠IL-2和IL-6的血清水平與TNF-α變化趨勢(shì)相同，呈下降趨勢(shì)，說明燈臺(tái)葉堿對(duì)照射后SD大鼠IL-2和IL-6有一定抑制作用，在第4周血清IL-2和IL-6含量與地塞米松組持平，可見，燈臺(tái)葉堿能有效減輕炎性反應(yīng)；SD大鼠血清中的抗炎因子IL-4在燈臺(tái)葉堿干預(yù)后呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，表明燈臺(tái)葉堿能增強(qiáng)大鼠的免疫系統(tǒng)功能，刺激大鼠免疫系統(tǒng)自我調(diào)節(jié)以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，這種效應(yīng)在第4周時(shí)IL-4血清含量達(dá)到最高，高于地塞米松組血清IL-4水平，說明燈臺(tái)葉堿可能較地塞米松的抗炎效應(yīng)更佳。我們猜測(cè)其治療機(jī)制與文獻(xiàn)報(bào)道類似，為單萜吲哚類生物堿促進(jìn)支氣管平滑肌高爾基體鈣庫外流，激活PLC-IP3/DAGPKC信號(hào)通路而起到鎮(zhèn)咳作用[10]；同時(shí)可能通過增強(qiáng)組織內(nèi)谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，降低過氧化水平，達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的效果[11]。IL-2、TNF-α在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中趨勢(shì)相反，原因考慮為：①細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)中檢測(cè)細(xì)胞因子時(shí)樣本經(jīng)過放射治療后的時(shí)間并不相同，放療有延遲效應(yīng)，可能導(dǎo)致結(jié)果的差異；②細(xì)胞和動(dòng)物樣本在很多方面存在差異，可能導(dǎo)致最終細(xì)胞因子結(jié)果有一定差異。具體原因尚待進(jìn)一步研究。

本研究通過對(duì)燈臺(tái)葉堿的治療機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)燈臺(tái)葉堿可成為促炎因子的阻斷劑，有望成為臨床防治放射性肺炎的有效藥物。