蜈蚣中藥配伍減輕蜈蚣所致肝腎損傷的作用機制研究

田莎， 姚天振， 寧迪敏， 黃曉蒂， 鄭敏楠， 龍琰， 田雪飛

1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙 410208

《素問》言：“大積大聚。其可犯也，衰其大半而止，過則死”。故大積大聚者，非峻猛之藥不可攻不可散，此類藥物常具毒性，這種毒性功效是雙刃劍，惡性腫瘤非此類藥物不能衰，但稍有不慎則會正氣受損，肝腎功能損傷是安全性關鍵，而且是易受病人關注的敏感指標。研究組前期發現蜈蚣具有較好的抗肝癌活性[1]，然而，自古以來，蜈蚣一直被認為是有毒之蟲，大凡收載蜈蚣的中藥書籍均記載蜈蚣有毒，藥典和教科書皆謂蜈蚣性辛溫，有毒，《神農本草經》將蜈蚣列為下品。現代臨床研究、藥理研究表明蜈蚣具有肝腎毒性[2-7]。據此，甄選護肝中藥“靈芝”、扶正中藥“人參”、去莝中藥“大黃”配伍蜈蚣，對比其對蜈蚣所致肝腎損傷的修復作用，為臨床用藥提供依據。

1 材料、試藥與儀器

1.1 藥物蜈蚣(批號：201700854)、人參(批號：2017020170)、靈芝(批號：2016090107)、大黃(批號：2016016470)購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，蜈蚣經鑒定為少棘巨蜈蚣。

1.1.1 蜈蚣提取液的制備 蜈蚣干燥全蟲，粉碎；加入10倍蒸餾水，浸泡30 min后煎煮提取1h左右，過濾，收集濾液；再次加8倍的蒸餾水，煎煮提取1 h左右，過濾，收集濾液；合并兩次煎煮的濾液，并過濾一次，將濾液隔水蒸至相當于0.6 g生藥/mL原液。以0.6 g生藥/mL原液，80℃水浴30 min，連續3d間歇滅菌后，1 000 rmp離心10 min，-4℃保存。

1.1.2 靈芝、人參、大黃水提液制備 分別取靈芝、人參、熟大黃加入10倍蒸餾水浸泡30 min，武火煮沸后用文火煎煮30 min，過濾，收集濾液。再加蒸餾水8倍，煎煮提取30 min左右，合并兩次濾液，濾液用旋轉蒸發儀濃縮成濃度至相當于0.1 g生藥材/ml。以0.1 g生藥材/ml的原液，80℃水浴30 min，連續3 d間歇滅菌后，1 000 rmp離心10 min，-4℃保存。

1.2 動物SD大鼠60只，體重180～220 g、雄性。購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號為：SCXK(湘)2016-0002，飼養于中南大學動物實驗室屏障系統內，濕度：46%～51%，溫度：26～28℃，SPF級環境，實驗前適應性喂養1周。

1.3 實驗試劑大鼠MDA ELISA檢測試劑盒(北京綠源伯德生物科技有限公司)。

1.4 儀器設備超凈工作臺(SW-CJ-ICV，蘇凈安泰公司，中國)；自動酶標儀(TECAN，奧地利)；臺式離心機(TDZ5-40，長沙天創儀器公司，中國)；高壓蒸汽消毒器(ZDX-35B，上海申安器械廠，中國)；超聲波清洗機(杭州大和熱磁力電子公司，中國)；DF-10A搖擺式中藥粉碎機(溫嶺市奧力中藥機械有限公司，中國)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥將60只SD大鼠隨機分為正常對照組、蜈蚣組、蜈蚣+靈芝組、蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組，每組12只。根據經驗和文獻[5，8]，同時參照《藥理試驗方法學》中人與動物體表面積折算的比值表計算，除正常組外，每組均灌胃蜈蚣水煎液4.5 g生藥量/kg(相當于臨床劑量的10倍)，其他組在此基礎上再分別灌胃靈芝(1.08 g生藥/kg)、人參(0.8 g生藥/kg)、大黃(0.45 g生藥/kg)(相當于臨床劑量)，劑量根據人的臨床劑量換算而成。正常對照組每日灌胃等體積蒸餾水。實驗期間動物自由進食和飲水，給藥量為3 mL/d/只，每日1次，連續14 d。

2.2 肝腎功能檢測各組大鼠連續用藥14 d后，禁食16 h，麻醉，腹主動脈取血，血液于室溫下靜置1 h，待凝固后，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清4℃凍存備檢。OLYMPUS AU640全自動生化分析儀測定。

2.3 肝臟組織脂質過氧化物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)測定制備10%肝組織勻漿，離心取上清液100μL，按照大鼠MDA ELISA試劑盒步驟，檢測MDA含量。

2.4 病理學檢查肝臟組織切片經HE染色，光鏡下觀察肝細胞損傷程度。

2.5 統計學方法數據采用SPSS 18.0統計軟件處理，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間多重比較如方差齊采用LSD檢驗，如方差不齊采用Dunnett T3檢驗，P<0.05表示有統計學意義。

3 結果

3.1 體重及一般情況蜈蚣+大黃組部分大鼠在用藥第3天開始出現排稀便，程度較輕，持續到實驗結束，其余各組大鼠排褐色軟便。在實驗期間，未觀察到動物豎毛、驚厥、抽搐、小便失禁等嚴重的中毒反應，大鼠無一死亡。各給藥組及正常對照組在14d給藥期內精神良好，行為活潑，毛色光澤，進水及攝食正常。各組間比較，體重無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

3.2 對谷丙轉氨酶的影響組間多重比較結果顯示，蜈蚣組谷丙轉氨酶(ALT)高于正常組(P＜0.05)；蜈蚣+靈芝組、蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組的谷丙轉氨酶(ALT)低于蜈蚣組(P＜0.05)(表1)，即靈芝、人參、大黃能降低谷丙轉氨酶，改善蜈蚣所致肝損傷。

3.3 對血肌酐的影響組間多重比較結果顯示，蜈蚣組血肌酐(SCr)高于正常組(P＜0.05)；蜈蚣+靈芝組、蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組的血肌酐低于蜈蚣組(P＜0.05)(表1)，即靈芝、人參、大黃能降低血肌酐，改善蜈蚣所致腎損傷。

表1 各組體重、谷丙轉氨酶、血肌酐、丙二醛比較(±s)Table 1 Comparison of weight；ALT；SCr and MDA in each group(±s)

表1 各組體重、谷丙轉氨酶、血肌酐、丙二醛比較(±s)Table 1 Comparison of weight；ALT；SCr and MDA in each group(±s)

注：與正常組比較：①P<0.05；與蜈蚣組比較：②P<0.05。

組別正常組蜈蚣組蜈蚣+靈芝組蜈蚣+人參組蜈蚣+大黃組MDA(nmol/mL)50.98±6.66 81.14.± 13.36①59.69±12.06②52.89±4.02②65.22±12.74②n 12 12 12 12 12體重(g)303.3±25.2 294.6±34.0 301.3±26.4 298.6±33.3 280.6±39.0 ALT(U/L)34.07±2.15 40.13±1.30①33.85±1.05②35.88±3.25②35.28±3.50②SCr(mmol/L)19.60±0.60 25.00±2.00①19.50±5.50②21.00±2.85②19.00±2.54②

3.4 對肝組織MDA含量的影響組間多重比較結果顯示，蜈蚣組MDA高于正常組(P＜0.01)；蜈蚣+靈芝組、蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組的MDA含量低于蜈蚣組(P＜0.01)，見表1，提示靈芝、人參、大黃具有抗脂質過氧化作用。

3.5 對肝組織病理變化的影響與正常組比較，蜈蚣組大鼠肝組織損傷嚴重，可見的肝細胞腫脹，呈氣球樣變，胞質疏松，部分細胞核溶解、壞死；并有炎癥細胞浸潤。蜈蚣+靈芝組上述癥狀明顯減輕，與蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組相近(圖1)，提示靈芝、人參、大黃對大鼠肝細胞損傷有保護作用。

圖1 各組肝組織HE染色（×150倍）Figure 1 Liver tissues from each group were excised and prepared for HE staining（×150）

4 討論

蜈蚣具有一定的抗腫瘤活性，被廣泛運用于各種腫瘤的治療。臨床治療惡性腫瘤時，蜈蚣用量較大，且用藥時間長，而蜈蚣作為有毒中藥，具有肝腎損傷的風險。蜈蚣劑量過大可引起中毒，其中毒潛伏期約30分鐘至4小時。中毒患者的主要表現為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、全身無力、不省人事、心跳及脈搏緩慢、呼吸困難、體溫及血壓下降[9]。若出現溶血反應，可伴有醬油色尿，黑便，溶血性貧血癥狀。大劑量服用蜈蚣粉后可致肝功能損害(5條/日，服用2天)[6]及急性腎功能衰竭死亡(2條/日，服用3天)[10]。前期研究發現相同劑量蜈蚣作用于肝癌荷瘤小鼠和正常小鼠，其肝毒性存在差異。為取得類似的肝毒性，本研究各組蜈蚣的用量選用臨床劑量的10倍[[11]，結果表明，大劑量的蜈蚣提取液具有肝腎毒性。

肝癌治療中，蜈蚣常與養肝、扶正等藥物配伍。本研究甄選靈芝、人參、大黃配伍蜈蚣，觀察其對蜈蚣肝腎損傷的拮抗作用。有“護肝仙草”之稱的靈芝能補五臟之氣，減少不良反應中藥毒所致。近年大量關于靈芝的藥理研究證明，靈芝及其有效成分具有獨特的保護肝臟，減輕肝損傷的作用，可明顯減低因藥物引起的血清谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶的含量、降低肝臟甘油三酯含量、增加對肝炎病毒的耐受性等作用[12，13]。本研究發現其具有拮抗蜈蚣所致肝腎損傷作用。人參具有大補元氣，補脾益肺的作用，有研究表明其具有抗炎、抗過敏、抗休克、抗腫瘤等活性，同時人參及人參皂苷對酒精性肝損傷[14]、梗阻性黃疸大黃肝損傷、藥物性肝損傷[15，16]、免疫性肝損傷[17]等均有修復作用。本研究結果表明，人參對蜈蚣所致肝腎損傷具有一定修復作用。

大黃作為具有代表性的攻下藥物，具有攻下積滯、利膽退黃等功效。研究表明，大黃可通過改善內毒素血癥等途徑逆轉肝損傷[18]。李杲曰：“大黃能推陳致新，如戡定禍亂，以致太平”，具有利膽、瀉下、利小便之功效，具有利二便將藥毒排除的可能，且有研究發現其具有肝腎保護作用[19-22]，被應用于藥物性肝腎損傷治療。本研究結果表明，大黃同靈芝、人參一樣，具有肝腎保護作用。據此推測，下法可能是一種“去莝除毒”的積極療法。

MDA是脂質過氧化反應的主要產物，可嚴重損傷細胞膜的結構，導致細胞腫脹與壞死，其含量可反映組織過氧化損傷的程度。機體組織MDA含量的增加或減少間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。多個文獻報道，肝損傷發生時，肝臟MDA含量亦同時升高[23，24]，本實驗證實大劑量的蜈蚣可使小鼠血清ALT活性明顯上升，同時肝組織MDA含量明顯增加，靈芝、人參、大黃均可顯著降低小鼠血清ALT活性和肝組織MDA含量，提示靈芝、人參、大黃具有明顯的抗肝損傷作用，其作用機制可能與抗脂質過氧化有關。本研究探索靈芝、人參、大黃等中藥配伍對大劑量蜈蚣所致藥物性肝腎損傷的修復作用，以期為臨床合理譴方用藥提供參考。