家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28基因位點的連鎖分析

劉彩霞，孫 維，田智敏，史寶和，居乃新，陳秋惠

家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇(Familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE)是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病。近年來，國內外研究者將FCMTE致病基因進行了粗略的定位。目前，已發現了多個該病的致病基因位點，但因該病具有遺傳異質性，是否存在其他致病基因位點仍需進一步研究。本課題組對已報道的8q23.3-24.1和10p15致病基因位點進行連鎖分析，結果未發現該病的致病基因與上述2個基因位點連鎖[1]。本文繼續對2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28這2個致病基因進行連鎖分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我們已報道的臨床確診的家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇一家系[2]，患者7例和對照者13例(患者的直系親屬及配偶，其中1例為可疑病例)。確診的患者臨床特點符合以下診斷標準[3]：①連續3代發病，呈常染色體顯性遺傳，男女均受累，均成年起病；②主要表現為癲癇發作，部分患者在光刺激、驚嚇或情緒刺激時誘發全面強直發作，伴肢體遠端震顫；③口服苯巴比妥等抗癲癇藥物有效，口服β受體阻滯劑無效，為非進展病程；④軀體感覺誘發電位檢查支持震顫來源于皮質。

1.2 研究方法與試劑

1.2.1 樣品采集與DNA提取 在獲得受試者知情同意后采其外周血5 ml，用家系編號，詳細標記血樣。利用血液基因組DNA提取試劑盒(天根)提取各樣本基因組DNA。

1.2.2 選擇與設計微衛星引物 我們根據已報道的2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28染色體位點，在NCBI mapview圖譜中找到這些區域中合適遺傳距離的STR(見表1)。

1.2.3 PCR反應、產物處理、毛細管電泳及結果收集 對選擇的STR位點分別合成5’標記FAM的熒光引物及普通引物，然后進行熒光引物標記的PCR反應。在ABI PRISM 3730 DNA Analyzer上用PE公司的POP-4分離膠，15 KV、60 ℃下，電泳30 min，選用ABI PRISM GeneMapper Software(Ver 3.5)收集實驗數據，進行分子量內標校正和擴增片段大小分析，并讀取全部微衛星標記物等位基因片段的大小。

1.2.4 基因型分析及連鎖分析 利用GeneMapperV3.5進行基因分型，確定家系中各個樣本在每個STR標記處的分型情況。在Linkage5.1軟件中設定疾病基因頻率、疾病外顯率及擬表型頻率，θ=0～0.5進行連鎖分析，記錄優勢對數記分(log odds score，LOD)。

2 結 果

我們分別在2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28染色體區段各選取的4個STR位點，在θ=0.0時這些STR位點與致病基因的兩點LOD值均<-2，具體分析結果見表2、表3。

表1 2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28染色體位點所選擇的STR信息及引物序列

注：F：Forward primer；R：Reverse primer

表2 2p11.1-q12.2染色體區段STR位點與該家系致病基因兩點連鎖分析

表3 3q26.32-3q28染色體區段STR位點與該家系致病基因兩點連鎖分析

3 討 論

家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇(familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE)是一種少見的遺傳性癲癇綜合征，又稱良性成人家族性肌陣攣性癲癇(benigh adult familial myoclonic epilepsy，BAFME)、家族性成人肌陣攣癲癇(familial adult myoclonic epilepsy，FAME)等，是一種具有臨床異質性和遺傳異質性的常染色體顯性遺傳疾病。目前，世界對該病家系的報道僅有100多個，主要分布在意大利和日本兩國，日本報道的家系已超過60例，荷蘭、意大利、土耳其等國家也有相關報道。近年來，我國也對該病家系陸續做了報道。隨著遺傳學研究工作的不斷深入，該病逐漸被人們重視起來。

早些年，日本和意大利研究者將FCMTE家系的致病基因粗略的定位于8q23.3-24.1和2p11.1-q12.2，但遺傳分析結果顯示相關致病基因與上述兩個基因位點不連鎖[4，5]。近年來，5p15.31-p15、3q26.32-3q28和10p15等多個基因位點陸續在法國、泰國和中國被發現[6，7]。Cen等在FCMTE家系中發現SAMD12基因內含子區(TTTGA)n插入突變；在SAMD12中，非編碼TTTCA和TTTTA 重復序列的擴增被認為是與8q24相關的亞洲FCMTE家系的主要致病原因[8～15]。本研究采用的是基于家系研究的連鎖分析方法，利用連鎖的原理研究致病基因與遺傳標記的關系，是對該疾病的相關基因位座不明而采用的遺傳分析手段。連鎖分析包括實驗分析和數據分析兩個方面。優勢對數記分法(log odds score method，LOD法)是數據分析最常用的統計學方法。用優勢對數記分法進行分析需要準備以下方面的資料，即家族史調查、診斷資料、遺傳標記物資料及分型信息。本文即是對已報到的 FCMTE 家系的基因定位研究進行報道。常用的DNA分子遺傳標記物包括單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)、限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)。本研究選取的DNA分子遺傳標記物為STR。STR是基因組中由2-6個堿基作為核心單位的短串聯重復結構，又稱微衛星DNA(micro satellite DNA)，是一種可遺傳、具有高度多態性的短串聯重復序列，遵循孟德爾遺傳定律呈顯性遺傳，其具有在基因組中分布廣泛、高度多態性、基因片段短、擴增效率高、判型準確等特點。判斷連鎖的標志是當LOD>1時，表示存在連鎖；LOD>3時，表示肯定連鎖；LOD<-2時，表示否定連鎖；通常-23是必要的。我們的實驗已針對國內外報道的8q23.3-q24.1和10p15對應短臂2-8 M區段的多個STR標記進行連鎖分析，結果顯示不支持連鎖，說明我們的家系致病基因并不在這兩個染色體區[1]。本文繼續針對2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28各選擇4個STR標記進行連鎖分析，結果顯示在θ=0.0時，我們分析的這些STR位點與致病基因的兩點LOD值均<-2，由此推斷此家系的致病基因位點不在2p11.1-q12.2和3q26.32-3q28。但還存在以下可能：(1)我們選擇的STR位點在本家系的雜合率相對較低或由于STR標記在染色體區段密度相對小；(2)我們的家系樣本量不足夠大；(3)NCBI數據庫的STR Marks 是以歐洲人群為模板的，STR具有人種和地域性，而雜合度受遺傳背景的影響比較大，對我國人群針對性不夠強，以致造成STR位點的等位基因變化范圍、雜合度、重復單元等數據與數據庫報道有一定出入。

總之，盡管本研究的實驗結果為陰性，但為FCMTE的遺傳學研究提供了一份良好的研究資料。我們在后續的研究工作中將嘗試使用不同的連鎖分析方法對分型結果進行分析，或繼續在相應的區域增加樣本量；或增加本病的其他家系，以累加LOD值；通過各種計算結果綜合判斷。