水處理生物學創新實驗
——領略微生物之美

謝依僑， 孟佩佩， 李 祎

（暨南大學環境學院，廣州511443）

0 引 言

水處理生物學是給排水科學與工程專業一門重要的專業基礎課，主要介紹水處理工程和環境水體水質凈化過程中所涉及的生物學問題［1］，對學生的實踐動手能力要求很高，不僅需要重視理論教學的深度和廣度，同時也必須注重實驗教學環節［2］?？v觀各高校水處理生物學實驗課的教學項目，基本都設置了“考察微生物生理生化特性”這一綜合性實驗，學生通過實驗統計總大腸菌群數和細菌總數。因為總大腸菌群、細菌總數是自來水廠2 個重要的出水衛生學指標，所以熟練掌握這個實驗對今后從事水務工作的同學來講是必不可少的［3］。但是該實驗幾乎涉及到了微生物實驗所有的基礎操作技能，因此學生們必須先掌握顯微鏡的使用與微生物形態觀察、微生物染色技術、培養基的制備與滅菌、微生物純種分離和接種技術等基本實驗操作技能。

如何在緊扣大綱的基礎上，創新實驗課程的組織形式、完善實驗教學及評價機制，對整個教學活動的實際效果及教學目標的順利完成起到非常重要的作用［4-5］。因此，設計了一個新型的實驗——領略微生物之美，來代替原本枯燥無味的微生物驗證實驗。該實驗不僅涵蓋了上述所需掌握的微生物實驗技能，而且增添了實驗的趣味性，可激發學生的學習興趣，全面提高學生的綜合應用能力與創新性思維［6-8］。同時，借助互聯網平臺，鼓勵學生拍攝記錄下實驗過程中遇到的問題或特殊實驗現象，通過分享討論，提高他們分析問題、解決問題的能力，老師也會拍攝下學生在實驗過程中的錯誤操作，上傳至平臺以規范操作細節，而且每位同學在實驗后需將總結報告分享至平臺，再組織學生互評，強調學生的主體地位，充分提高學習的質量與效果［9-11］。

1 水處理生物學實驗授課思路

根據課程的教學大綱，水處理生物學實驗是由基礎微生物實驗和綜合性實驗（測定水樣中的大腸菌群數和細菌總數）兩部分組成，這兩個部分看似獨立，其實是密切關聯的，只有掌握了基礎微生物操作技能，才能順利開展綜合性實驗，所以以一個創新實驗涵蓋所有的基礎微生物實驗，為后續實驗的開展奠定基礎。在第一次實驗課上要對本學期所開設的實驗項目進行梳理，讓每個學生有規劃地去進行學習，以達到事半功倍的效果。

2 微生物作畫實驗目的及原理

基礎的微生物實驗技能是水處理生物學課程的學習基礎，合理安排這些實驗項目的先后順序以及選擇合適的組織形式，對于系統學習起到重要的輔助作用［12］。利用“不同微生物顏色、形態各不相同”這一特點，以微生物做顏料、平板培養基做畫板進行創新實驗，在合適溫度下培養一段時間，讓微生物菌落在平板上長出各種各樣的圖案。從菌的篩選、純菌液的獲取、培養基的制備、繪圖到培養，每個環節都需要學生親自動手，盡力而為，充分鍛煉他們的微生物實驗操作技能。多個微生物小實驗構成了這個創新實驗，而每一個小實驗的設置都有其目的，必須按照一定的順序去進行，學生們通過這個實驗，不僅領略到了微生物之美，還學會靈活地運用這些技能，更好地去完成后續的綜合性實驗，更重要的是能充分提高學生的創新及綜合應用能力［13］。

3 微生物作畫實驗步驟

3.1 實驗材料、儀器及實驗流程

3.1.1 實驗材料

兩種混合菌液，1 號混合菌液含大腸桿菌及銅綠假單胞菌，2 號混合菌液含白酵母和紅酵母；玻璃器皿包扎用材料（紗布、報紙、棉線、棉花、透氣橡膠塞）；滅菌指示膠帶；配制培養基的材料（牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、營養瓊脂、氫氧化鈉、葡萄糖、酵母粉、麥芽提取物、XRD瓊脂培養基粉末、蒸餾水）；接種環、接種針、一次性接種環及接種針（不同規格）；酒精燈；香柏油；革蘭氏染色液；無水乙醇。

3.1.2 實驗儀器

各種玻璃儀器；鼓風干燥箱；高溫高壓蒸汽滅菌鍋；培養箱；搖床；無菌操作臺；顯微鏡。

3.1.3 實驗流程

微生物作畫實驗的大致流程如圖1 所示。

圖1 微生物作畫實驗流程

3.2 查閱文獻

在這個趣味實驗中，獲得純培養的菌種并完成活化是獲得染料的關鍵步驟，而這必須建立在合適的微生物培養條件之上（見表1）。在老師指導下，學生通過查閱文獻確定大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白酵母及紅酵母的培養條件，包括培養基的成分、pH 值、培養溫度、培養時間，如果是液體培養基，還需考慮振搖的轉速。同時也了解了每一種微生物菌落的顏色、哪幾種微生物可以在同一個培養基上生長，學生們還通過文獻了解到XRD瓊脂培養基也適合大腸桿菌及銅綠假單胞菌的生長，且其顏色為鮮紅色，不同于近無色的營養瓊脂培養基，故決定將其作為候選畫板之一，這些文獻資料為后續的實驗開展奠定理論基礎。

表1 各微生物在液體及固體培養基的培養條件

3.3 實驗步驟

（1）玻璃器皿的洗滌、包扎及滅菌。玻璃器皿的洗滌對于微生物實驗而言，起著至關重要的作用。對于新購的玻璃器皿需要先用1 ～2 mol/L 的硝酸溶液浸泡24 h，再用清水洗凈，以除去游離堿；而使用過的玻璃器皿，一般情況下只需用洗潔精水溶液洗刷，沖洗干凈后，再用純水淋洗數次，但是如果接觸過菌液的話，必須在121 ℃條件下高溫高壓蒸汽滅菌后，方可按一般玻璃器皿清洗，這一點是極為重要的，一方面殘留的菌液直接排入下水道會對環境造成極大污染，另一方面受污染的玻璃器皿極有可能會直接導致實驗失敗；與此同時，在微生物實驗中，經常需要用到移液管、吸管、載玻片和蓋玻片等不適合使用刷子進行清洗的玻璃器皿，這種情況下選擇用鉻酸洗液進行浸泡，再清水沖洗。但在本科教學中，這部分內容經常由實驗指導老師代勞，以至于無法引起學生的重視。

玻璃器皿的包扎也是一個考驗學生動手能力及細心程度的環節，包扎好的玻璃器皿的外層報紙上粘貼滅菌指示膠帶，用于確認每個玻璃器皿是否都達到了濕熱滅菌的要求，再在121 ℃下滅菌20 min即可。

在該創新實驗中，第1 次授課內容就是學習玻璃器皿的洗滌、包扎及滅菌，準備好的器皿將用于后續整個實驗，所以每個學生都要學會為自己的實驗負責，同時養成良好的實驗習慣。

（2）配制微生物純種分離所需的平板培養基。按照表1 處方配制好兩種瓊脂培養基，在不同條件下進行高壓蒸汽滅菌后，冷卻至40 ～50 ℃（摸上去不燙手），迅速注入培養基至鋪滿底部，立刻合上皿蓋，平皿靜置于桌上，冷凝即成平板，室溫放置過夜，使平板表面干燥無水膜。在這個步驟中，嚴格的無菌操作是極為重要的，如果玻璃器皿或者培養基被污染，過夜的培養基上通常會長雜菌，不可用于分離。確保平板表面的干燥，可有效改善分離效果。

（3）劃線和涂布以獲得單菌落。在進行分離前，學生需要將純水經高溫高壓蒸汽滅菌得無菌水，再以此稀釋菌液，稀釋倍數通常要達到106方可確保菌落呈分散生長，之后可用平板稀釋或平板劃線法進行分離。平板稀釋法是將菌液滴于平板中央，再用涂布器進行涂布。平板劃線法是用接種環取菌，接種環與平板成30°，前緣部位接觸平板，“之”字形劃線（見圖2）。接種好的平板室溫放置1 h，待接種菌液被培養基吸收后，倒置于37 ℃恒溫箱培養24 h，在室溫下培養2 ～3 d，使菌落性狀表現較充分。

圖2 平板劃線分離示意圖

相較于平板劃線，涂布的方法看似更為簡單，但很多同學在實驗過程中，由于沒有采取預實驗估計菌液合適的用量，導致菌落密度過高，無法區分開，合適的用量為1 d稀釋后的菌液（約為50 μL）。而平板劃線法對學生的操作要求更高，從上一區域引出菌液時，必須先灼燒接種環，否則起不到稀釋作用，但第4 步與第3 步之間可連貫進行，劃線的力度要恰當，否則容易刮破。

（4）斜面接種及純培養菌種的菌體形態觀察。制備試管斜面培養基及接種：試管斜面培養基與平板培養基的配方相同，區別在于，斜面培養基是借助漏斗將培養基分裝至試管后滅菌，然后趁熱將試管斜放，斜面長度一般不要超過試管長度的1/2，放置過夜即可。通過平板稀釋和平板劃線可在兩個培養基中分別得到5 種單菌落，按無菌操作法，分別將取了菌的接種環伸入試管，在培養基表面“之”字形劃線后密塞，按表1條件進行培養，可獲得純培養菌種。

純培養菌種的菌體形態觀察：對純培養的菌種進行革蘭氏染色以及鏡檢，不僅可判斷細菌的純度，還可進一步辨別菌體屬于革蘭氏陽性或陰性菌，并觀察其形態結構。在此基礎上，更好地保證“顏料”作畫的質量。一般來說，細菌的菌落比較光滑濕潤，可用接種環挑起極少量菌落進行革蘭氏染色，主要分4 個步驟，即取菌-涂片-染色（初染-媒染-脫色-復染）-鏡檢。在這個小實驗中，有幾個細節會直接影響實驗結果，包括取菌的量不可過多，否則涂片后菌落會重疊，導致脫色效果變差，無法觀察到真實菌體情況；初染和媒染時，用純水沖洗后不要用酒精燈烘干，否則殘留的染料容易附著在玻片上；鏡檢時必須依次使用低倍鏡、高倍鏡、油鏡進行調焦，根據“物鏡同焦”這一現象，理論上在使用了低倍鏡后再使用高倍鏡、油鏡等放大倍數高、工作距離短的物鏡時，僅用細調節器即可清晰聚焦，而且用油鏡觀察完樣本后，不可隨意切換回高倍鏡和低倍鏡，防止玻片上的鏡油污染干鏡的鏡頭。

（5）液體接種及純菌活化。在確認了菌落的純度之后，需要將其由斜面接種至滅菌的液體培養基，進行活化，以獲得“顏料”。取菌的工具為接種環，必須先灼燒滅菌后，在試管玻璃內壁或空白培養基處冷卻，待培養基不再被接種環融化時，即可用環蘸取少量菌，然后迅速將接種環移入液體培養基中，輕輕攪拌，封口，合適條件下進行培養。

（6）進行圖案設計并作畫、培養。學生根據自己的喜好，選擇合適的平板和菌液進行作畫，圖案自行設計且顏色自由搭配，但由于少量的菌液在平板上劃線時，很快就被吸收，學生無法追蹤之前畫過的痕跡，提出先在濾紙上用黑色水筆設計好圖案，將其墊于培養皿下方，可透過培養基看到圖案，再以一次性接種環或接種針進行作畫［見圖3（a）、（b）］。選擇一次性的接種環或接種針［見圖3（c）、（d）］主要是因為其材質為聚丙烯，相比于傳統鎳鉻合金的接種環和接種針，不會那么尖銳，即使力度把握較差的學生也不會輕易劃破培養基的表面。

4 微生物作畫實驗教學與評價機制

圖3 圖案設計及作畫工具

為了建立更合理的教學與評價機制，借助互聯網學習平臺，鼓勵學生拍攝記錄下實驗過程中遇到的問題或特殊的實驗現象，課后上傳至學習平臺與同學一起討論分析，鍛煉學生發現問題、分析問題與解決問題的能力。授課老師與實驗指導老師在實驗課堂上，拍攝記錄下學生在實驗操作過程中存在的問題，上傳至學習平臺與全體學生分享，從而讓所有學生能夠更規范地進行實驗操作。

該趣味實驗是由6 個小實驗構成的，每1 次實驗結束后，同學們需要對其進行總結，并將實驗報告上傳至學習平臺，組織學生進行互評，評價標準在于其價值性，憑借這份報告是否可以有效地規避實驗的雷區，提高成功的概率，以及加深對理論的認識和理解。最后師生一起參與微生物作畫成品的投票，主要從顏色、構圖等方面綜合考慮評選出排名前三的作品（見圖4），分享他們成功畫出精美圖案的實驗技巧?？梢?，先在濾紙上繪圖并以此為基礎進行作畫是完全可行的，為后續的操作發揮良好的輔助作用，而且學生所呈現的畫作也是極具創意的。

圖4 微生物作畫的優選作品展示

5 結 語

根據給排水科學與工程專業的培養方案和課程設置，水處理生物學一般開設在大學二年級第一學期，是學生進入高校以來開設較早的專業課，所以實驗技能、實驗思想、實驗習慣的好壞會直接影響其他實驗課程的開展甚至科研水平［14］。

在水處理生物學實驗中，借助微生物作畫的趣味實驗，將以往枯燥的玻璃器皿包扎、培養基制備及滅菌、微生物接種及分離、顯微鏡使用等內容融匯貫通在一起，每一個小實驗之間都有一定的必然聯系，看似獨立，實則相通，這樣的教學模式不只是為了提高學生對實驗的興趣，更多的是讓學生們帶有目的性地去完成每個小實驗，這對于他們切實掌握微生物操作技能有較大幫助。由于每一步驟的成敗都會直接影響下一個環節，所以學生們對實驗的關注度會顯著提高，通過前期準備，促使他們查閱文獻，學會將理論應用于實踐（如微生物培養條件、培養基的篩選等），在實踐中加深對理論的認識和理解。

每一個小實驗完成后，學生們需要對其進行總結，但與一般的實驗報告有所不同，要求只有一點，“若今后他們要再次運用到這些微生物操作知識時，這份總結可以幫助他們順利地去完成實驗”，這樣一來，很多學生選擇了圖文結合的方式記錄下每個細節，將可能影響結果的因素加以注解，這個過程中得到的不只是一幅微生物作品，更多的是學習心得，濃縮起來仿佛是微生物實驗書的一個縮影，相信對于學生今后學習其他相關實驗課程都會有指導意義。每一位同學都將自己的實驗總結上傳至學習平臺，組織學生進行互評，讓每一個學生都有機會充當小老師，從另一個角度思考去發現自己在實驗中的不足，增強學生參與感，從而提高教學質量與效果。作品完成后，師生共同參與點評，評選出排名前三的作品，并進行獎勵，比如贈予水處理生物學創新實驗相關的書籍，激發他們的興趣，鼓勵學生們參與大學生創新實驗比賽，進一步提升自我。

該趣味實驗采用創新的教學與評價模式，在保證完成教學任務的前提下，激發學生學習的興趣，提高學生在實驗中的參與度，強調學生的主體地位，從學生的角度出發，更好地去幫助他們理解實驗的現象及結果，并且學會從中進行總結概括，對于今后學習其他實驗課程乃至科研工作奠定良好的基礎［15-16］。