枳殼類中藥材干燥果實(shí)DNA提取方法的優(yōu)化實(shí)驗設(shè)計

李明娟， 黃 嬛， 金 莉， 金佩芬， 黃越燕， 丁寶月

（1.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興314001；2.嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江嘉興314001）

0 引 言

實(shí)驗教學(xué)在藥學(xué)教學(xué)中占有較大比重，在藥學(xué)人才培養(yǎng)中處于十分重要的地位，對培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗技能和創(chuàng)新能力有著不可替代的作用［1-5］。將學(xué)科前沿引入到實(shí)驗教學(xué)中，可以引導(dǎo)學(xué)生更加有效地學(xué)習(xí)和運(yùn)用基礎(chǔ)知識，感受學(xué)以致用的樂趣，激發(fā)創(chuàng)新思維，培養(yǎng)創(chuàng)新能力［6-9］。

枳殼為常用中藥，是蕓香科植物酸橙（Citrus aurantiumL.）及其栽培變種黃皮酸橙C. aurantium‘Huangpi’、代代花C. aurantium‘Daidai’、朱欒C.aurantium‘Chuluan’、塘橙C. aurantium‘Tangcheng’的干燥未成熟果實(shí)。臨床主要用于治療胸悶脹痛、食積不化、痰飲、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等癥［10］。由于枳殼品種繁多、種植區(qū)域廣泛，來源復(fù)雜，兼之以次充好、以假充真，使得同物異名、同名異物現(xiàn)象嚴(yán)重，枳殼交易市場混亂，為研究和臨床用藥帶來不便。因此，如何有效、快速地鑒定枳殼成為一個亟須解決的問題。DNA分子標(biāo)記技術(shù)在中藥材鑒定中具有廣泛的應(yīng)用，具有微量、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、對樣本要求較低［11-13］的特點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)生藥鑒定方法的不足。DNA提取是DNA 分子標(biāo)記技術(shù)中關(guān)鍵的一步，能否順利進(jìn)行后續(xù)鑒定取決于提取的DNA 的質(zhì)量。中藥材是干品，且經(jīng)炮制加工成碎片，很難用基原、外觀、顯微及理化等常規(guī)方法進(jìn)行鑒別。中藥材中的DNA 可能會在炮制和貯藏過程中受到破壞，存在不同程度的DNA降解現(xiàn)象。枳殼類中藥材分子鑒定也同樣存在上述問題［14］。因此，如何從枳殼類中藥材干燥果實(shí)中提取高質(zhì)量的DNA 成為其分子鑒定的一個難題。本實(shí)驗的設(shè)計采用改良的DNA 提取方法對4 種枳殼類藥材（朱欒、香櫞、枳殼、代代花）的干燥果實(shí)不同部位進(jìn)行DNA提取，比較提取質(zhì)量，優(yōu)化提取條件，有利于藥學(xué)專業(yè)學(xué)生認(rèn)識學(xué)科發(fā)展前沿、提升科研創(chuàng)新能力。

1 實(shí)驗材料與方法

1.1 藥 材

實(shí)驗所用的4 種枳殼類栽培變種由浙江省食品藥品檢驗研究院提供。樣本信息詳見表1。

表1 樣品來源表

1.2 儀器與試劑

PCR相關(guān)試劑，快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（DP321）購于天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；實(shí)驗中的儀器包括PCR 擴(kuò)增儀BIO-RAD DNA Engine，核酸電泳儀Power Pac Basic，Bio-Rad 公司的凝膠成像系統(tǒng)Molecular Imager? Gel Doc TM XR ＋System。

1.3 實(shí)驗設(shè)計

1.3.1 朱欒DNA的提取

以朱欒的干燥果實(shí)為取材對象，按照DNA提取方法的不同分為試劑盒組、改良組，每一組根據(jù)采樣部位的不同分為外果皮、中果皮、囊及內(nèi)果皮組。試劑盒組按照快捷型植物基因組DNA 提取系統(tǒng)（DP321）的操作說明進(jìn)行DNA提取，改良組的提取方法如下：①取枳殼類藥材樣品組織約50 mg，研成極細(xì)粉（要求過120 目篩），裝入5 mL EP管中。②在EP管中加入0℃超純水，置于0 ℃冰箱浸泡約30 h，每隔10 h 換1次水。12 000 r/min離心5 min，用移液槍小心移去上清液，開蓋置于40 ℃烘箱中晾干。③將緩沖液FP1和FP2 置于37 ℃水浴中預(yù)熱約2 min（若天氣炎熱，此步驟可省略不做）。④在樣品中加入1 000 μL 緩沖液FP1 和15 μL RNaseA（10 mg/mL），渦旋振蕩1 min，60 ℃水浴20 min，每隔5 min 劇烈搖蕩一次。⑤繼續(xù)加入325 μL 緩沖液FP2，充分混勻，渦旋振蕩1 min。⑥12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)至新的離心管中。⑦重復(fù)⑥。⑧向上清液中加入0.2 倍2.5 M的NaCl 和0.7 倍體積的異丙醇，充分混勻，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，保留沉淀。⑨加入600 μL 70%乙醇，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心2 min，棄上清液。⑩重復(fù)⑨。○1 開蓋倒置，置于40 ℃烘箱徹底晾干殘余乙醇。○12 加入50 μL 滅菌蒸餾水或超純水溶解（60 ℃水浴助溶），期間顛倒混勻數(shù)次，最終得到DNA 溶液。○13 所得DNA 溶液可置于4 ℃冰箱備用，若長期不用可保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2 其余3 種藥材DNA的提取

以3 種枳殼類藥材香櫞、胡柚、枳殼、代代花的干燥果實(shí)作為取材對象，取材部位均選取5 種藥材的外果皮，按改良后的提取方法進(jìn)行DNA提取。

1.4 提取DNA的濃度、純度測定

取10 μL DNA樣品，用超純水稀釋至60 μL，以超純水為空白對照測定其濃度、A260／A280和A260／A230值，并記錄數(shù)據(jù)。

1.5 DNA瓊脂糖電泳

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠，8 μL DNA樣品與2 μL上樣液混合后加入加樣孔中，電泳槽電壓調(diào)至120 ～140 V，待loding buffer 跑到下游2/3 ～3/4處，關(guān)閉電源，將膠塊浸沒于EB 染色液中染色10min，取出后用清水漂洗數(shù)次，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，拍照留存。

1.6 PCR擴(kuò)增

以提取的DNA為模板，引物選取及擴(kuò)增體系參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行［3］，引物序列詳見表2，PCR擴(kuò)增體系詳見表3。擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠（EB染色）上電泳，用凝膠成像儀拍照，分析。

表2 PCR擴(kuò)增引物序列

表3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)20 μL反應(yīng)體系

2 結(jié) 果

2.1 DNA提取方法的優(yōu)化

朱欒是中藥材枳殼的一種栽培變種，以朱欒外果皮為取材對象，分別按試劑盒操作和改良后的提取方法（以下分別簡稱為方法1 和方法2）進(jìn)行DNA提取，由表4 可見，用改良的方法提取到的DNA 純度較高，A260／A280值較接近標(biāo)準(zhǔn)值1.8，A260／A230的比值也在2.5附近，DNA瓊脂糖電泳結(jié)果也證明改良方法提取到的DNA條帶更清楚（見圖1），說明改良后提取到的DNA純度較高。雖然表4 中，試劑盒方法提取的DNA濃度較高，但是參照A260／A280及A260／A230的比值可以推斷所含雜質(zhì)較多，不代表真實(shí)的DNA濃度。

表4 不同方法提取朱欒外果皮DNA濃度和純度檢測結(jié)果

圖1 不同方法提取朱欒DNA電泳圖

2.2 樣品取材部位的不同對DNA提取的影響

分別取朱欒外果皮、中果皮、囊及內(nèi)果皮用改良后的方法進(jìn)行DNA提取，稀釋DNA提取液進(jìn)行DNA濃度測定和瓊脂糖電泳測定，以AW88 為引物進(jìn)行ISSRPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢測結(jié)果見表5。

表5 不同取材部位提取朱欒DNA濃度和純度檢測結(jié)果

從表5 可知，DNA 提取液濃度順序：外果皮＞內(nèi)果皮＞囊＞中果皮；DNA 提取液A260／A280的值只有外果皮的最接近標(biāo)準(zhǔn)值1.8；DNA 提取液A260／A230的值外果皮2.64，比較接近標(biāo)準(zhǔn)值2.5；說明外果皮提取的DNA質(zhì)量最好，濃度和純度也均比其他部位高。

DNA電泳圖（見圖2）中，外果皮的條帶最清晰明亮；內(nèi)果皮次之；囊的條帶較為模糊，難以辨別；中果皮無DNA 電泳條帶出現(xiàn)。該結(jié)果說明外果皮提取的DNA質(zhì)量最好。

圖2 不同部位提取朱欒DNA電泳圖

如圖3 所示，外果皮DNA 的PCR 產(chǎn)物最清晰明亮，內(nèi)果皮次之，中果皮和囊相近。這進(jìn)一步說明外果皮提取DNA更適合朱欒分子鑒定的后續(xù)反應(yīng)。

圖3 不同部位提取朱欒DNA的ISSR-PCR電泳圖

2.3 枳殼類藥材DNA提取

選取3 種枳殼類藥材香櫞、枳殼、代代花作為實(shí)驗對象，取材部位均選取5 種藥材的外果皮，按改良后的提取方法進(jìn)行DNA 提取，由表6 所示可見，不同品種的枳殼類藥材，DNA 提取濃度稍有差異，純度尚可，A260／A280的值均在1.8 附近。

表6 不同品種枳殼類藥材DNA提取液的濃度和純度檢測結(jié)果

在圖4 所示的PCR 產(chǎn)物電泳圖中，5 條引物中AW88、AW90 均能使3 種枳殼品種的DNA 擴(kuò)增出清晰明亮的多態(tài)性條帶。AW102、AW103、AW241 引物擴(kuò)增后為出現(xiàn)清晰條帶。

圖4 改良法提取3種枳殼類藥材外果皮DNA的ISSR-PCR電泳圖

3 實(shí)驗教學(xué)效果

通過本實(shí)驗，使學(xué)生掌握了干燥枳殼的DNA提取及優(yōu)化方法。干燥中藥材的DNA 受到了不同程度的破壞，易降解，因此實(shí)驗設(shè)計時通過優(yōu)化水浴溫度、裂解時間、藥材粉碎度及取材部位等因素，比較實(shí)驗結(jié)果，讓學(xué)生充分裂解中藥材DNA 提取時的注意事項，掌握凝膠電泳、DNA濃度純度測定等基本的分子實(shí)驗技能，大大激發(fā)了學(xué)生的科研熱情，培養(yǎng)了學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。

4 結(jié) 語

本實(shí)驗中優(yōu)化了枳殼類中藥材干燥果實(shí)的DNA提取方法，并證實(shí)外果皮部分更適于提取DNA用于后續(xù)鑒定反應(yīng)，為干燥中藥材的DNA提取及分子鑒定提供了一定的參考。實(shí)驗內(nèi)容可行性較強(qiáng)，可在現(xiàn)有的實(shí)驗室基礎(chǔ)上開展，開拓了學(xué)生的科學(xué)視野，激發(fā)了學(xué)生對科學(xué)研究的濃厚興趣。實(shí)驗中加入了對各影響因素的優(yōu)化，內(nèi)容多樣，并加入自主查閱文獻(xiàn)及總結(jié)環(huán)節(jié)，提高了學(xué)生綜合分析問題的能力。教學(xué)實(shí)踐表明，學(xué)生非常喜歡參與到這類研究型實(shí)驗，研究型實(shí)驗可以將學(xué)生的專業(yè)課知識學(xué)以致用，在分析科學(xué)問題時進(jìn)一步鞏固所學(xué)到的專業(yè)基礎(chǔ)知識。