GJB2基因檢測聯合聽力篩查在新生兒聽力損失篩查中的應用

趙雪卉，劉宗印，張娟，唐凱，蔣曉穎

寶雞市婦幼保健院產科1、醫教科2、院遺傳室3，陜西 寶雞 721000

先天性聽力損失是新生兒先天性缺陷性疾病之一，臨床發病率0.1%～0.3%[1]，先天性聽力損失影響患兒語言發育和身心發育，給家庭和社會帶來沉重的負擔。新生兒聽力篩查有助于早期發現先天性聽力障礙患兒及其高危因素。但是新生兒先天性聽力損失臨床表現復雜，發病時間不確定，部分患兒可為進行性、遲發性聽力損失，采用常規物理聽力篩查存在較高漏診率[2]。縫隙連接蛋白β2(GJB2)基因參與內耳鉀離子循環，GJB2基因突變可影響鉀離子通道轉運蛋白改變，進而導致鉀離子循環和轉運異常，出現聽力損失[3-4]。因此建立聽力篩查和聽力損失易感基因檢查對臨床積極采取干預措施，改善患者預后有重要意義。本研究探討新生兒聽力篩查聯合GJB2 基因多態性檢測在新生兒先天性聽力損失診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年6 月至2018 年6 月于寶雞市婦幼保健院產科分娩的1 220例足月新生兒為研究對象，所有新生兒家屬均知情并同意進行聽力篩查和GJB2 基因多態性檢測。其中男性650 例，女性570 例；胎齡36～42 周，平均(39.42±3.45)周；母親年齡24～38 歲，平均(30.75±5.61)歲；出生體質量2 500～4 102 g，平均(3 412.52±146.75)g；陰道分娩760 例，剖宮產460 例；出生阿氏評分9.5～10 分，平均(9.80±8.16)分。聽力損失高危因素：聽力損失家族史35 例，宮內感染16 例，高膽紅素血癥19 例，新生兒窒息21 例，妊娠期母親服用至聽力損失藥物13 例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬均知情并簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 聽力篩查方法 對無聽力高危的新生兒生后48～72 h 在產科病房進行初篩，篩查儀器(丹麥爾聽美)為耳聲發射儀，環境噪聲＜40 dB。具體操作：患兒自然睡眠，用消毒棉簽清潔外耳道，選用大小合適的耳塞，順著外耳道的方向，輕輕放入耳道內，測試聲強為35 dB，瞬態短純音，測試結果儀器自動判斷，以Pass (通過)或Refer (未通過)顯示結果。初篩結果為Refer的嬰兒，42 d復查。復查流程：腦干聽覺誘發電位+瞬態耳聲發射+寬頻聲導抗三聯檢查，腦干聽覺誘發電位采用德國專科公司生產MB11，環境噪聲要求＜45 dB，刺激信號為CE-Chirp 聲，刺激水平35 dB，仍為儀器自動分析，結果為通過或轉診(未通過)；耳聲發射檢查同初篩；寬頻聲導抗采用丹麥Titan 專用儀器，環境噪聲＜45 dB，行耳鏡檢查排除耳道耵聹及外耳道濕疹及中耳炎后，患兒自然睡眠，選用合適耳塞，使外耳道與耳塞密閉，做出聲導抗圖由耳鼻喉醫生判讀。腦干+耳聲均通過，聲導抗無問題，進行隨訪觀察，對于腦干+耳聲均未通過者，轉西安交大二附院聽力診斷中心進一步診治，聽覺誘發電位通過，耳聲發射有問題多數伴聲導抗不正常，給予門診治療。

1.2.2 GJB2基因檢測 新生兒出生后3 d采足底血3 mL置于2%EDTA抗凝試管中，取100 μL樣本，加入紅細胞裂解液混勻，冰浴15 min，4℃離心3 min，棄上清，加入5%Chelez 100 200 μL 充分混勻，56℃孵育20 min，震蕩10 s，離心2 min，取上清儲存于-20℃低溫冰箱保存備用。取DNA液60 μL，應用AU1001核酸提取儀及配套試劑(北京百泰克公司)提取DNA，以Tris-HC1做空白對照，UV7500雙光束紫外可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)鑒定DNA純度和完整性，取吸光度(A260/280nm)值在1.6～1.8，濃度＞50 ng/μL的DNA樣品待檢。采用晶芯遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(上海Invitrogen生物技術有限公司提供)對耳聾基因進行篩查，檢測方法為微陣列芯片法，將血樣送至我院完成常見4 個耳聾基因15 個熱點突變位點(454 例新生兒)，即GJB2 基因的35 del G、176 del 16、235 del C 和299 del AT 4 個位點，SLC26A4 基因的2168 A＞G、IVS7-2 A＞G，GJB3 基因的538C＞T 位點，線粒體12s rRNA 基因的1555A＞G 和1494 C＞T，SLC26A4基因的1174 A＞T、1226 G＞A、1229 C＞T、1975 G＞C、2027 T＞A、IVS15+5 G＞A，4 個基因出現任一位點的雜合突變即為耳聾基因篩查“未通過”標準。

1.3 統計學方法 應用SPSS 25.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，以率(%)表示計數資料，采用四格表計算聽力篩查和GJB2基因檢測技術診斷新生兒聽力損失的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。

2 結果

2.1 新生兒聽力篩查結果 1 220例新生兒聽力篩查陽性35例；聽力學診斷15例聽力損失，其中輕度3例，中度5例，重度4例，極重度3例。

2.2 GJB2 基因檢測結果 1 220 例新生兒GJB2基因突變55 例，見表1，其中IVS7-2 A ＞G 比例最高，為30.91%，其次為235 del C，比例為25.45%。

表1 GJB2基因檢測結果

2.3 聽力篩查、GJB2 基因檢測結果比較 聽力篩查陽性、GJB2 基因檢測結果見表2，其中16 例聽力篩查陽性、GJB2基因檢測陽性者最終經聽力學診斷13例聽力損失；19 例聽力篩查陽性、GJB2基因檢測陰性者最終經聽力學診斷1 例聽力損失；39 例聽力篩查陰性、GJB2基因檢測陽性者最終經聽力學診斷1例聽力損失。

表2 聽力篩查與GJB2基因檢測結果比較(例)

2.4 聽力篩查、GJB2 基因檢測聯合診斷新生兒聽力損失 以聽力學診斷為準，聽力初篩診斷新生兒聽力損失靈敏度為26.67%，特異度為91.70%，陽性預測值為3.85%，陰性預測值為99.01%。聽力復篩診斷新生兒聽力損失靈敏度為53.33%，特異度為97.76%，陽性預測值為22.86%，陰性預測值為99.41%。GJB2基因檢測診斷新生兒聽力損失靈敏度為80.00%，特異度為96.43%，陽性預測值為21.82%，陰性預測值為99.74%。以聽力篩查和GJB2基因檢測結果均陽性為陽性判斷標準，聯合聽力篩查和GJB2基因檢測對新生聽力損失的診斷靈敏度率為86.67%，特異度為99.75%，陽性預測值為81.25%，陰性預測值為99.83%，見表3。

表3 聽力篩查、GJB2基因檢測聯合診斷新生兒聽力損失效能(例)

3 討論

新生兒聽力篩查是臨床上已經較為普及的聽力篩查方法，是預防耳聾的基本措施，有助于早期發現和診斷新生兒聽力損失，減少因聽力障礙導致的語言、神經、精神發育異常，保證兒童健康成長[5]。耳聲發射法和快速腦干聽覺誘發電位是新生兒聽力篩查的有效方法，耳聲發射法反映耳蝸外、傳音結構功能，操作方法簡單易掌握，檢查時間短，但是容易受到外耳、中耳狀態的影響，需要在新生兒自然睡眠和安靜環境中進行，易漏診耳蝸后病變，假陰性率高[6]。本研究初篩陽性新生兒中4 例經聽力學診斷為聽力損失，聽力初篩診斷新生兒聽力損失靈敏度僅為26.67%。快速腦干聽覺誘發電位反映耳禍、聽神經、腦干聽覺通路功能，幾乎不受中耳道碎屑影響，是聽神經疾病檢查的首選，適合新生兒聽力復篩檢查[7]。本研究采用耳聲發射法初篩、快速腦干聽覺誘發電位復篩聯合應用將新生兒聽力損失診斷靈敏度提高至53.33%，有效降低假陽性率及假陰性率。

GJB2 基因編碼連接蛋白是電解質、代謝產物、第二信使在細胞之間轉換的重要通道，其中CX26 蛋白在耳蝸中高度表達，GJB2基因突變可導致耳蝸聽力傳導異常，導致聽力損失的發生。現代研究認為GJB2是非綜合性、遺傳性耳聾常見耳聾隱性遺傳基因，也是突變頻率最高的致聾基因，GJB2突變引起的聽力損失占整體的12.88%[8-9]。GJB2基因突變可導致不同程度聽力損失，多數為重度或極重度感音神經性耳聾，因此本研究選擇GJB2 基因作為新生兒聽力損失篩查的檢測指標。相關報道顯示聽力篩查陽性新生兒GJB2基因突變檢出率更高，GJB2基因突變患兒遲發性聽力損失發生率高[10-11]。本研究GJB2基因檢測突變55例，檢出率為4.51%，說明GJB2 突變基因有較高攜帶率，其中在GJB2 基因突變中，IVS7-2 A＞G 比例最高，為30.91%，其次為235 del C，比例為25.45%，與其他研究結果一致[12-13]。本研究中1 例GJB2 235delC 純和突變經聽力學診斷為重度聽力損失，說明35delC純和突變攜帶者具有更高的聽力損失風險和更重的聽力損失程度。GJB2 基因檢測陽性中共12 例診斷為聽力損失，GJB2 基因檢測診斷新生兒聽力損失靈敏度為80.00%，明顯高于聽力篩查，說明GJB2基因檢測有較高聽力損失檢出效果。GJB2 基因雜合攜帶者少見發病，但與GJB2基因雜合攜帶者婚配可導致后代發病，產前進行GJB2 基因檢測有助于防止子代聽力損失的發生，而聽力篩查在新生兒娩出診斷具有滯后性，這也是GJB2基因獨特的優勢。

但是目前認為大量聽力損失相關基因尚未被探知，因此單純依靠聽力損失相關基因檢測存在一定局限性，聽力篩查與聽力損失相關基因聯合檢測是新型的新生兒聽力篩查方法，有助于提高語前聽力損失檢出率，本研究聯合聽力篩查和GJB2基因檢測對新生聽力損失的診斷靈敏度率達86.67%，陽性預測值也提高至81.25%，說明聽力篩查聯合GJB2 基因檢測可最大程度為新生兒聽力障礙提供確切診斷。

綜上所述，新生兒聽力篩查、GJB2 基因檢測是新生兒聽力損失的有效篩查手段，聯合兩種方法檢測則有助于提高新生兒聽力損失檢出率，降低漏診率，是新生兒聽力障礙篩查的有效手段。