分離缺陷蛋白6α在膠質瘤中的表達及其對臨床病理和預后的意義

王帥，潘景臻，華實，張健，衡雪源

1.濰坊醫學院臨床醫學院，山東 濰坊 261053；

2.臨沂市人民醫院微創與功能神經外科，山東 臨沂 276002

膠質瘤是一種來源于神經外胚葉組織、由大腦或脊髓膠質細胞癌變導致的原發性顱腦腫瘤，年發病率為3～8 人/10 萬人口[1]，經綜合治療后中位生存期仍較短，死亡率極高，盡管接受了手術切除和放化療，膠質母細胞瘤(GBM)的平均生存時間只有12～15個月[2]。研究表明，膠質瘤的發生與進展是多基因、多步驟共同作用的結果[3]，因此從病因學研究腦膠質瘤的發病機制對腦膠質瘤患者的早期診斷和治療以及提高腦膠質瘤患者的生命質量具有重要的意義。分離缺陷蛋白6 α(partitioning defective protein 6 homolog alpha，PARD6A)基因是PAR 家族的成員，該家族目前共發現了6 種PAR基因(PAR1-6)，其中PAR6 有三個基因亞型，分別是PARD6A、PARD6B和PARD6G，均可編碼PAR6蛋白，其分子量為37 000 kD，該細胞膜蛋白作為多蛋白復合物的成員參與不對稱細胞分裂和細胞極化過程[4]。最新的研究表明，細胞的不對稱分裂和細胞極化過程的異常均與腫瘤的發生和發展密切相關[5]。因此，對分離缺陷蛋白的研究將對腦膠質瘤的早期診斷、臨床治療及預后具有重要意義。

本研究利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫、GTEx 數據庫收集GBM、低級別膠質瘤(LGG)和正常腦組織(Normal)的mRNA 及臨床信息資料，結合免疫組化實驗，分析膠質瘤中PARD6A的差異性表達與臨床病理學參數及預后的相關性。下載KEGG 數據庫內的分子特征數據庫(Molecular signatures database，MsigDB)，利用基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)技術研究PARD6A 在膠質瘤中涉及的信號通路，研究PARD6A 在膠質瘤中可能的發病機制，探討其作為潛在靶點的可行性，為膠質瘤的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本研究中的膠質瘤數據來源于TCGA 數據庫中下載的膠質瘤GBM、LGG 數據集(leve3，mRNA-seq、Clinical)；Normal 基因表達數據來源于GTEx 數據庫(Genotype-Tissue Expression Project(GTEx)Brain-Cortex-GTEx mRNA-seq)。

1.2 資料篩選方法 下載GTEx數據庫內正常腦組織中PARD6A 的mRNA-seq 表達數據114 例；下載TCGA 數據庫中GBM 的mRNA-seq 數據167 例，LGG的mRNA-seq 數據524 例，利用Rx643.4.1 整理。納入標準：(1)基因表達數據和臨床數據完整；(2)患者經手術治療且病理結果確診為GBM或LGG。將患者信息整合為包含mRNA-seq 表達量、臨床參數和生存資料的數據集，與GTEx 數據庫內正常腦組織中PARD6A的mRNA-seq表達量進行差異性分析。

1.3 PARD6A 表達與臨床病理學的相關性 對TCGA 和GTEx 數據庫內膠質瘤相關PARD6A 的mRNA 和臨床數據加以分析得出，GBM 和LGG 兩組數據的PARD6A-mRNA表達量總的中位值為9.78，以PARD6A-mRNA 表達量的中位數為標準，設定≤9.78=1，＞9.78=2，將數據分為高表達組和低表達組，研究PARD6A 表達量與年齡、性別、膠質瘤病理級別及生存狀態的關系。

1.4 對PARD6A 進行生存分析 表達譜動態分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA) (http://gepia. cancer-pku.cn/) 是 一 款TCGA 和GTEx 數據庫在線可視化網頁工具，可以對目的基因進行Kaplan?Meier Plotter在線數據生存分析。本研究中，選擇GBM-Tumor 和LGG Tumor 數據集后，利用GEPIA對PARD6A進行總生存期(overall survival，OS)和無病生存期(disease free survival，RFS)分析。

1.5 對PARD6A 進行單基因富集分析 以TCGA 數據庫內PARD6A-mRNA 表達量的中位值為基準，將膠質瘤內PARD6A-mRNA 表達量的數據分為高表達(H)組和低表達(L)組，從分子特征數據庫(Molecular Signatures Database，MsigDB)下載參考集2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt，根據缺省加權富集法，隨機組合的數量定為1 000 次，名義P 值(nominal P-values，NOM P)＜0.05，錯 誤 發 現 率(false discovery rates，FDR)＜0.25，GSEA2.2.1 軟件進行基因富集分析，分析PARD6A參與的信號通路。

1.6 PARD6A與關鍵基因的基因的相關性 根據PARD6A 富集分析得出的信號通路，尋找這些通路中已知的關鍵基因，通過GEPIA對基因PARD6A和這些關鍵基因進行相關性分析。

1.7 臨床標本的收集和隨訪 本研究所采用臨床標本共68例，其中膠質瘤樣本58例，均源于在2015年1 月至2017 年10 月期間在臨沂市人民醫院微創與功能神經外科接受手術治療的原發腦膠質瘤患者；對照組腦組織樣本10例，來自于同時期急性重型顱腦損傷顱內減壓患者。所有膠質瘤標本均按照世界衛生組織(WHO 2007)神經上皮腫瘤分類標準對膠質瘤組織標本進行分級，其中Ⅰ級膠質瘤10 例，Ⅱ級膠質瘤18例，Ⅲ級膠質瘤15例，Ⅳ級膠質瘤15例。所納入膠質瘤標本均經我院病理科證實，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤患者術后均進行了替莫唑胺標椎化療方案。所有腦組織的獲取均已通過醫院倫理委員會的通過。隨訪納入實驗的58例膠質瘤患者的1年和2年腫瘤復發情況。

1.8 實驗試劑 PAR-6家族細胞極性調節因子α抗 體(Afffinity 公 司，DF7166-100)；磷 酸 鹽 緩 沖 液(PBS，pH 7.2～7.4)，0.01 mol/L 檸檬酸鈉抗原修復液(50X)，增強型DAB 顯色試劑盒(20X) (索萊寶)，通用二步法檢測試劑盒(中衫，FV-9000-6)。

1.9 免疫組織化學法 按照通用二步法檢測試劑盒說明書對石蠟切片依次放入二甲苯、梯度乙醇中進行脫蠟、水化。微波爐高火加熱0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將組織切片放入進行抗原修復，低火維持20 min，自然冷卻至室溫后，置入蒸餾水中浸泡10 min；加入適量的內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；滴加50 μL一抗(1∶50 稀釋)，4℃冰箱過夜孵育；滴加100 μL反應增強液，室溫孵育20 min，滴加100 μL 增強酶標兔抗山羊IgG 聚合物，室溫孵育20 min。每次操作前后均用PBS 沖洗3 min×3次，加入適量新鮮配制的DAB顯色液，室溫孵育5～8 min。自來水沖洗，蘇木素染色液孵育20 s；分化、沖洗返藍，然后脫水、封片，對照組不加入一抗，以等量PBS代替，閱片由兩名經驗豐富的病理醫師依據雙盲法獨立進行。

1.10 免疫組化染色結果評判標準 高倍鏡視野下，每個組織樣本隨機選取5個視野，依據高倍鏡視野下染色呈陽性結果的細胞在整個視野中所占比例以及陽性細胞的染色強度判定。染色結果按顯色細胞數記分：無陽性染色細胞為0分，陽性細胞數≤25%為1 分，陽性細胞數26%～50%為2 分，陽性細胞數＞50%為3 分；按細胞顯色深淺記分，無陽性反應細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項積分相乘，0～2為陰性表達，3～9為陽性表達。

1.11 統計學方法 應用SPSS21.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，三樣本的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；計數資料采用以百分率(%)來表示，PARD6A 免疫組化結果與腫瘤級別的關系分析采用χ2檢驗，目的基因與關鍵基因的相關性分析采用皮爾遜(Pearson)法。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。生存分析采用Kaplan?Meier在線分析。采用GSEA2.2.1版軟件從分子標簽數據庫(Molecular Signatures Database，Msig-DB)中獲得參照基因集2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt，然后按缺省加權富集統計的方法對PARD6A 進行單基因富集分析，設置隨機組合次數為1 000 次，GSEA 中選取NOM P＜0.05、錯誤發現率(false discovery rates，FDR)＜0.25的基因集作為顯著富集基因集。

2 結果

2.1 PARD6A RNA-seq 表達水平比較 對TCGA 和GTEx 數據庫中PARD6A mRNA-seq 的表達數據進行檢驗發現，GBM組PARD6A mRNA-seq表達量最低，其次為LGG 組，Normal 組PARD6A mRNA-seq表達量最高，三組間差異具有統計學意義(F=195.548，P＜0.05)。三組經LSD 法兩兩比較顯示，Normal 與GBM、Normal 與LGG 以及LGG 與GBM 任意兩組間的差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表1、圖1。

表1 TCGA 數據庫和GTEx 數據庫中PARD6A mRNA-seq 表達水平比較

表1 TCGA 數據庫和GTEx 數據庫中PARD6A mRNA-seq 表達水平比較

注：與Normal組比較，aP＜0.05；與LGG組比較，bP＜0.05。

組別GBM組LGG組Normal組數量167 524 114 PARD6A mRNA-seq 9.31±4.98ab 10.78±4.30a 19.58±5.63b F值195.548 P值＜0.05

圖1 PARD6A mRNA-seq在TCGA和GTEx數據庫中的基因差異性表達

2.2 PARD6A mRNA-seq 的表達與臨床病理學參數的關系 采用χ2檢驗對PARD6A 低表達量組和PARD6A 高表達量組的年齡、性別、腫瘤級別及術后2 年的生存狀態進行數據分析。結果顯示，PARD6A RNA-seq 表達量與患者的年齡和性別無關(P＞0.05)，但是PARD6A RNA-seq 表達量與膠質瘤病理級別以及術后2 年的生存狀態有關(P＜0.05)，見表2。

表2 PARD6A mRNA-seq的表達與臨床病理學參數比較[例(%)]

2.3 生存分析 PARD6A Kaplan-Meier Plotter在線數據生存分析顯示：無論是OS 還是DFS，PARD6A高表達組(紅線)生存曲線均在低表達組(藍線)之上，且在50 個月左右時差別明顯(圖2)，即PARD6A 低表達組OS 及RFS 較PARD6A 高表達組均明顯縮短，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖2 PARD6A在TCGA數據庫中的生存分析

2.4 基因富集分析 使用GSEA 分析PARD6A對其他生物功能基因集的影響，結果顯示高表達PARD6A的腫瘤樣本富集了35條有意義的信號通路，差異均有統計學意義(P＜0.05)，其中包括Wnt 信號通路(圖3A)、GnRH 信號通路(圖3B)、ErbB 信號通路(圖3C)和CALCIUM信號通路(圖3D)。

2.5 PAR6蛋白在外傷腦組織和膠質瘤組織中的表達水平比較 免疫組化實驗結果顯示，Par6蛋白主要位于細胞核中，陽性染色為棕色。外傷腦組織中Par6蛋白陽性占90.0% (9/10)；Ⅰ～Ⅱ級中陽性占53.6% (15/28)；Ⅲ～Ⅳ級中陽性占20.0% (6/30)。經χ2檢驗分析表明，Par6蛋白在GBM組織中含量最低，其次為LGG組織，腦外傷組織樣本中最高，差異有統計學意義(χ2=16.632，P＜0.001)(表3、圖4)。以PAR6 蛋白表達情況分組，統計其術后1 年和2 年的腫瘤復發率，結果顯示，PAR6低表達組術后1年和2年腫瘤復發率分別為45.9%和71.8%，PARD6A 高表達組術后1 年和2 年腫瘤復發率分別為14.3%和23.8%，無論術后1 年還是2年的腫瘤復發率，低表達組相比高表達組均明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表3 正常腦組織及不同級別膠質瘤組織中PARD6A 表達水平比較[例（%）]

2.6 基因相關性表達 TGFB1、Twist1、Snail 和Slug 是Wnt 信號通路中的關鍵基因，本研究中利用GEPIA 對 基 因PARD6A 和TGFB1、Twist1、Snail 和Slug進行了Pearson相關性分析，結果顯示PARD6A與TGFB1、Twist1、Snail 和Slug 的Pearson 相關系數R 分別為-0.44、-0.28、-0.34和-0.28，R值均為負數，且差異具有統計學意義(P＜0.05)，提示PARD6A 與TGFB1、Twist1、Snail和Slug均呈負相關，見圖5。

圖3 采用GSEA 2.2.1版軟件對PARD6A進行單基因富集分析得到的部分信號通路

圖4 正常腦組織(A)，WHOI～IV級膠質瘤(B～E)的免疫組化圖像(油鏡400×)

表4 不同PARD6A表達水平患者術后膠質瘤復發情況比較[例（%）]

圖5 PARD6A與TGFB1、Twist1、Snail和Slug的相關性

3 討論

神經膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，起源于神經上皮組織，這些腫瘤的特征在于無限的細胞增殖和極強的侵襲性[6]。隨著生物信息學技術的發展，世界多個國家相繼建立了多個大型數據庫，數據庫的建立為理解腫瘤發生的機制以及尋找有效的的生物標志物提供了極其巨大的支持[7]。本研究通過生物信息學技術，利用TCGA 和GTEx 以及KEGG 等數據庫內的數據資料，首次報道了PARD6A 在膠質瘤中的作用。PARD6A 在腫瘤發生發展中所扮演的重要作用，有研究顯示PARD6A在乳腺癌[9]、肺癌[10]和前列腺癌[11]的發生發展中有著重要作用，然而尚未發現關于PARD6A在膠質瘤中的研究。

在本研究中，通過分析TCGA 和GTEx 數據庫中膠質瘤內PARD6A-mRNA和臨床數據，發現PARD6A在膠質瘤中呈明顯低表達，并且其表達量與膠質瘤的病理分級有關，其中GBM組PARD6A表達量最低，其次為LGG 組，Normal組PARD6A表達量最高，經兩兩比較和三組數據的方差分析，差異均具有統計學意義。由于TCGA和GTEx數據庫包含的是mRNA水平的表達數據，無法反應蛋白水平的表達情況，因此本研究通過收集臨床外傷腦組織和膠質瘤組織標本，對PARD6A進行了蛋白水平的檢測。免疫組化實驗結果顯示，PAR6 蛋白主要位于細胞核中，陽性染色為棕色。PAR6蛋白在腦外傷組織樣本中明顯高于LGG和GBM組織，且膠質瘤病理級別越高，PAR6表達越低，染色越淺(P＜0.001)。免疫組化的結果從蛋白水平驗證了TCGA和GTEx數據庫中膠質瘤內PARD6A-mRNA數據，因此本實驗從mRNA水平和蛋白水平均證明基因PARD6A在膠質瘤中低表達，且膠質瘤病理級別越高，PARD6A 表達越低，染色越淺。通過對數據庫內數據分析還發現，PARD6A 的表達量還與患者的生存狀態有關(P＜0.001)，高表達組患者的生存率顯著高于低表達組，提示低表達的PARD6A 可能影響膠質瘤的預后。為探究PARD6A對膠質瘤患者生存的影響，利用GEPIA對PARD6A進行了Kaplan?Meier Plotter在線數據生存分析，結果顯示PARD6A 低表達組患者的OS及RFS均較PARD6A高表達組低，并且在術后50個月左右時差別明顯，即PARD6A 表達越低，患者的生存率越低。為了探究PARD6A 表達水平與患者預后的關系，本研究根據免疫組織化學實驗中PARD6A表達情況的結果，結合對納入實驗的58例膠質瘤患者的隨訪數據，統計其術后1年和2年膠質瘤復發率，結果顯示無論是術后1年還是2年的腫瘤復發率低表達組相比高表達組均明顯升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)。綜合Kaplan?Meier Plotter在線數據生存分析的結果，以及對膠質瘤患者術后1 年和2 年的腫瘤復發率的統計，認為PARD6A的表達與預后之間具有顯著的相關性，PARD6A表達下調明顯影響膠質瘤的預后。

本研究為尋找PARD6A 在膠質瘤中可能參與的機制，從KEGG 數據庫內下載MsigDB 分子參考集(2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt)，利用基因富集分析技術和GSEA 4.0.0 軟件對PARD6A 在膠質瘤中涉及的信號通路進行基因富集分析。結果富集得到包括Wnt 信號通路和ErbB 信號通路、GnRH 信號通路和CALCIUM 信號通路，其中Wnt 信號通路在膠質瘤中的研究較為透徹，本研究將以該通路為主要研究內容。

在PAR 家族中，PAR3 與PAR6 關系最為密切。PAR3、PAR6 與非典型蛋白激酶C(aPKC)是極性復合體的重要組成部分，共同協調建立細胞極性[11]。這些極性復合物定位于上皮細胞的細胞連接(緊密連接和粘附連接)處，可為極性和上皮功能的建立提供一個中心調控通路[13]。在本研究中通過基因富集分析發現PARD6A 參與Wnt 信號通路。Wnt 通路的失調與乳腺[14]、結腸[15]和中樞神經系統[16]等多種組織的癌變有關。在腫瘤轉化過程中，Wnt/β-catenin途徑常常異常激活，并且通過促使β-catenin 磷酸化和(或)核定位增加影響腫瘤的遷移和侵襲[17]。此外，Wnt/β-catenin 途徑還可以誘導上皮-間質轉化(EMT)，因為激活的Wnt/β-catenin信號觸發了一組EMT激活因子的表達，包括Twist1、Snail和Slug[18]。EMT與癌細胞的遷移和侵襲能力密切相關，是腫瘤侵襲和轉移的關鍵步驟[1]。在EMT 過程中，上皮細胞失去頂端-基底極性和細胞間連接，從而獲得間充質運動表型[19-20]。巧合地是，EMT 的特征之一就是通過抑制相關極性基因的轉錄而致使細胞極性的喪失[21]。在EMT 過程中，由基因TGFB1 編碼的轉化因子β(TGF-β)因作為調控者而具有關鍵作用。TGF-β可誘導PAR6 發生磷酸化，通過TGF-β-PAR6 極性途徑抑制細胞極性形成，進而發生EMT，最終引起腫瘤的無序增殖和轉移[22]。當前對EMT 在上皮性腫瘤中發揮的作用已有較多研究。EMT是上皮來源的腫瘤獲得侵襲、轉移以及耐藥表型的重要原因[23]。然而惡性膠質瘤是否發生EMT，過去一直存在爭議[24]，但近年來越來越多的證據顯示，惡性膠質瘤細胞也能夠發生EMT或EMT樣改變[25]。因此有理由推測在膠質瘤中TGF-β可能通過TGF-β-PAR6極性途徑抑制PARD6A的表達，進而影響細胞極性的建立，引起Wnt 信號通路失調，Twist1、Snail 和Slug 的大量激活，進而誘導發生EMT，最終引起腫瘤侵襲和轉移的增強。不僅如此，本研究還利用GEPIA對基因PARD6A 和TGFB1、Twist1、Snail 和Slug 進 行 了Pearson相關性分析，結果顯示PARD6A與這些基因呈負相關，這從側面也為本研究提供了支持。此外，本研究通過富集分析還富集到了ErbB信號通路、GnRH信號通路和CALCIUM 信號通路在內的32 條信號通路，有研究表明這些信號通路在膠質瘤的發生和發展中扮演者重要角色[26-29]。

綜上所述，本文通過分析TCGA 數據庫和GTEx數據庫內的mRNA和臨床數據，同時結合免疫組化實驗，首次發現并證實了PARD6A基因在膠質瘤中表達下調，并且可能通過Wnt 信號通路、ErbB 信號通路、GnRH信號通路和CALCIUM信號通路影響膠質瘤的進展，進一步研究其影響膠質瘤增殖、侵襲和轉移的機制可以為腦膠質瘤的診斷及治療提供新的思路。