七葉亭調控Th1／Th2失衡對過敏性哮喘小鼠的抗哮喘作用

李 鎮 ，陳 亮 ，林敬明 ，卓 越 ，江朝娜

（1.海南省第三人民醫院呼吸內科，海南 三亞 572000； 2.海南醫學院形態學實驗室，海南 海口 571199）

過敏性哮喘是以氣道炎癥、氣道高反應性（AHR）和可逆性氣道阻塞為特征的氣道慢性炎癥性疾病，其病理特征包括炎癥細胞充盈、水腫，肥大細胞活化、氣道上皮細胞剝落和膠原沉積[1]。過敏性哮喘與CD4+T淋巴細胞亞群-輔助性T細胞1（Th1）／Th2及其特有的細胞因子的失衡密切相關[2]。Ⅰ型過敏是由對過敏原的特異性免疫反應引起的，主要由Th2細胞介導[3]。Th2細胞合成高水平的白細胞介素4（IL-4）、IL-5和 IL-13，導致過敏原特異性免疫球蛋白E（IgE）的釋放和肥大細胞介質的產生[4]。此外，誘導組胺和白三烯釋放的Th2細胞因子與 AHR 相關[5]。與 Th2細胞相比，干擾素 γ（IFN-γ）、IL-12等Th1細胞因子參與拮抗Th2細胞反應和IgE合成，抑制過敏性哮喘的進展[6]。近年來，抑制Th2細胞活化和調節Th1／Th2平衡來預防和治療哮喘受到關注[7]。七葉亭是天然藥物秦皮的有效活性成分，具有抗炎和調節免疫等多種藥理作用[8]。本研究中探討了七葉亭對過敏性哮喘小鼠的治療作用及對Th1／Th2細胞因子的影響，為其用于防治過敏性哮喘提供實驗依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：GYD-003型大小鼠肺功能檢測儀（法國Emka公司）；組織脫水機、包埋機、全自動輪轉切片機等病理配套設備（德國Leica公司）；Sunrise型全自動酶標儀（瑞士Tecan公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

試藥：七葉亭（浙江省湖州市之江有限公司，純度大于98%，批號為Z5250）；地塞米松磷酸鈉注射液（河南科倫藥業有限公司，批號為 13011911）；卵白蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠（美國 Sigma公司，批號分別為118K7002，MKBC0623）；醋甲膽堿（美國 Sigma 公司，批號為118K7028）；蘇木素染色液（上海碧云天生物技術研究所，批號為 C0107）；IFN-γ，IL-4和IgE酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司 ，批 號 分 別 為 mL063160，mL076941，mL059784）；CD3-APC，CD4-FITC，IFN-γ 抗體和 IL-4抗體（美國 BD公司，批號分別為 BD003-1-2，BD001-3-2，BD005-1-2，BD004-1-1）。

動物：C57BL／6小鼠購于河北醫科大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（冀）2012-0002。

1.2 動物分組、模型制備與給藥

選 60只體質量 25～30 g的雄性 C57BL／6小鼠，在SPF環境中自由進食和飲水，適應性喂養1周后。根據隨機數字表法將小鼠均分為對照組(A組)，模型組(B組)，地塞米松組(C組)和七葉亭低、中、高劑量組(D1，D2，D3組)，各10只。采用OVA聯合氫氧化鋁凝膠多次激發致敏法造模[9]。致敏階段：在實驗第1，8，15天對B組、C 組和 D1，D2，D3組小鼠腹腔注射 2%OVA 1 mL 和氫氧化鋁凝膠（200 ng／mL）1 mL；激發階段：在實驗第25～29天用霧化器泵入 1%OVA 溶液（0.2 mL），每日1次，持續5 d。A組用生理鹽水替代OVA和氫氧化鋁凝膠，其他操作相同。藥物干預：在第16～29天（連續14 d）D1，D2，D3組小鼠腹腔注射七葉亭（100，200，400 mg／kg），C 組小鼠腹腔注射地塞米松（1.25 mg／kg），作為陽性對照，A組和B組小鼠腹腔注射生理鹽水。末次給藥24 h后，處死小鼠。

1.3 觀察指標

氣道反應性測定：末次給藥24 h后，麻醉小鼠并固定，暴露氣管，在氣管上剪1個小口，插入插管并固定，連接小鼠肺功能儀。給予不同濃度的醋甲膽堿，記錄各組小鼠氣道阻力值。

病理學檢查：氣道反應性測定結束后，分離肺組織，右肺上葉用甲醛固定，經脫水、包埋、切片（3 μm），用蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織的病理改變。

ELISA法檢測 IFN-γ，IL-4和 IgE含量：結扎左側主支氣管近端和氣管遠端，在氣管結扎下端用0.3 mL預冷0.9%氯化鈉注射液進行左肺灌洗，重復3次，回收支氣管肺泡灌洗液，離心，取上清液，根據試劑盒說明書檢測支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ，IL-4，IgE的含量。

流式細胞術檢測Th1和Th2細胞：無菌取出脾臟，置含RPMI-1640培養基的EPP管中，制備單細胞懸浮液，接種于96孔板中，每孔200 μL，與乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA，50 ng ／mL）和離子霉素（1 g／L）在 5%CO2培養箱中孵育5 h。然后用抗小鼠CD3和CD4抗體，在4℃下標記細胞30 min。將細胞固定在Perm／Wash緩沖液中，在黑暗中透化 20 min，加入 IFN-γ和IL-4抗體，4℃孵育30 min，采用流式細胞儀檢測染色的細胞。

1.4 統計學處理

2 結果

結果見表1至表3和圖1至圖3。小鼠肺組織病理學檢查顯示，A組肺組織炎性細胞較少；B組肺組織中炎性細胞明顯浸潤支氣管周和血管周結締組織，主要為白細胞浸潤，且大多數白細胞是嗜酸性粒細胞；給予地塞米松和七葉亭后，與B組相比，炎性細胞浸潤明顯減弱；C組和D3組作用相似(見圖1)。

3 討論

過敏性哮喘是兒童和成人最常見的慢性呼吸道疾病，迄今已有多種治療過敏性哮喘的藥物如地塞米松、白三烯抑制劑、肥大細胞穩定劑和β2腎上腺素能受體激動劑，但僅能對癥治療，長期服用可能產生較嚴重的不良反應[10]。亞洲許多國家常用中草藥來治療過敏性哮喘，但尚不清楚其治療功效和作用方式[11]。本研究中，七葉亭作用于過敏性哮喘小鼠模型有效。

表1 不同醋甲膽堿質量濃度下各組小鼠氣道阻力值變化比較[±s，cmH2O ／(s·mL)]

表1 不同醋甲膽堿質量濃度下各組小鼠氣道阻力值變化比較[±s，cmH2O ／(s·mL)]

注：與 A 組比較，aP ＜0.05；與 B 組比較，bP ＜0.05；與 C 組比較，cP ＜0.05；與 D1組比較，dP ＜0.05；與 D2組比較，eP ＜0.05。下表同。

醋甲膽堿(m g／m L)組別0 A組B組C組D 1組D 2組D 3組1.8 2 ± 0.3 1 1.9 8 ± 0.4 2 1.7 5 ± 0.4 8 1.9 0 ± 0.6 3 1.7 9 ± 0.5 2 1.9 8 ± 0.2 7 3.1 2 5 2.5 0 ± 0.6 4 2.7 7 ± 0.9 9 2.9 6 ± 1.3 4 2.9 6 ± 0.4 8 2.8 3 ± 0.6 0 2.7 9 ± 0.9 2 6.2 5 5.7 3 ± 0.4 2 6.7 1 ± 1.1 0 6.1 6 ± 0.6 8 6.6 2 ± 0.7 4 6.3 7 ± 1.8 9 6.2 5 ± 1.2 5 1 2.5 8.3 6 ± 0.3 7 1 4.5 1 ± 1.0 2 a 1 0.4 2 ± 1.7 4 ab 1 3.8 9 ± 2.8 9 ac 1 2.6 3 ± 0.3 7 abcd 1 0.3 3 ± 1.8 5 abde 2 5 1 1.8 4 ± 1.4 0 1 6.9 2 ± 2.7 2 a 1 3.2 2 ± 1.6 3 ab 1 5.2 7 ± 0.4 7 abc 1 4.4 2 ± 0.8 4 abcd 1 3.2 8 ± 0.2 5 abde

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中IFN- ，IL-4，IgE含量比較（±s，pg ／mL）

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中IFN- ，IL-4，IgE含量比較（±s，pg ／mL）

組別A組B組C組D1組D2組D3組IFN-68.38 ± 4.59 24.47 ± 5.28a 52.63 ± 6.14ab 30.73 ± 3.91abc 41.82 ± 4.34abcd 51.78 ± 5.69abde IL-4 58.50 ± 6.64 94.57 ± 7.36a 62.26 ± 3.90ab 88.85 ± 4.07abc 75.87 ± 3.94abcd 63.84 ± 5.15abde IgE 0.07 ± 0.02 0.32 ± 0.06a 0.13 ± 0.03ab 0.25 ± 0.05abc 0.19 ± 0.04abcd 0.14 ± 0.02abde

表3 各組小鼠脾臟CD4+T細胞中Th1和Th2細胞百分率比較（±s）

表3 各組小鼠脾臟CD4+T細胞中Th1和Th2細胞百分率比較（±s）

組別A組B組C組D 1組D 2組D 3組C D 4+I F N- +（% ）2.4 2 ± 0.1 6 0.9 8 ± 0.1 0 a 1.7 4 ± 0.1 4 ab 1.1 2 ± 0.0 8 abc 1.4 6 ± 0.1 1 abcd 1.7 6 ± 0.5 1 abde C D 4+I L-4+（% ）2.2 1 ± 0.2 1 5.4 6 ± 0.3 2 a 2.7 1 ± 0.4 0 ab 4.2 5 ± 0.5 3 abc 3.9 4 ± 0.4 6 abcd 2.7 8 ± 0.6 8 abde T h 1／T h 2 1.1 5 ± 0.1 8 0.1 8 ± 0.0.0 4 a 0.6 5 ± 0.0 8 ab 0.2 4 ±0 0 4 abc 0.3 7 ± 0.0 4 abcd 0.6 2 ± 0.1 7 abde

氣道炎性細胞浸潤和AHR是過敏性哮喘的特征，AHR是通常在哮喘患者中觀察到的支氣管收縮的量度，由于氣道平滑肌（ASM）收縮或肥大引起的支氣管收縮和氣道炎癥可導致肺功能下降[12]。在給予醋甲膽堿質量濃度為 12.5 mg／mL和 25 mg／mL時，B組小鼠氣道阻力高于A組，用地塞米松和不同劑量的七葉亭干預可降低氣道阻力，且C組和D3組降低氣道阻力的效果相當。結果表明，吸入醋甲膽堿后七葉亭可抑制OVA誘導的AHR。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化

炎性細胞及細胞因子參與過敏性哮喘的發生，特別是嗜酸性粒細胞和淋巴細胞向肺的遷移是過敏性氣道炎癥發生的主要原因[13]。組織病理學研究結果顯示，七葉亭治療顯著減少了肺組織中白細胞浸潤和嗜酸性粒細胞浸潤。嗜酸性粒細胞調節樹突狀細胞和T淋巴細胞介導的依賴過敏原的Th2免疫應答，并減弱Th1應答[14]。在生理條件下，Th0細胞按比例分化為Th1和Th2細胞，且數量保持相對動態平衡。這種平衡一旦被打破，疾病就會發生。據報道，過敏性哮喘患者存在Th1／Th2細胞失衡[15]。Th1／Th2比值的變化被證實是哮喘增加氣道炎癥的一個初始因素，如能逆轉Th1／Th2細胞的不平衡狀態，就有可能成為哮喘治療的潛在有益藥物。Th2細胞合成高水平的IL-4，IL-5，IL-13，導致IgE的產生和肥大細胞釋放介質，誘導氣道炎性反應，如炎性細胞浸潤、嗜酸性粒細胞活化、黏液高分泌[16]。IFN-γ和IL-12參與拮抗Th2細胞反應和IgE合成，抑制哮喘的進展[17]。IgE是影響制訂抗哮喘策略的關鍵靶點，是引起過敏反應進展的重要因素之一。既往研究表明，抗IgE治療可能對過敏性疾病有效[18]，故推測IgE的產生和Th1／Th2細胞因子平衡是評價抗過敏性哮喘作用的重要指標。Rb1顯著抑制細胞因子IL-4和IgE水平，增加IFN-γ水平，恢復Th1／Th2比值接近正常水平，提示七葉亭可恢復哮喘患者Th1／Th2細胞的平衡。

圖2 各組小鼠脾臟中CD4+IFN- +細胞百分率比較

圖3 各組小鼠脾臟中CD4+IL-4+細胞百分率比較

氣道炎癥是由復雜的相互連接的信號網絡調控的，與哮喘相關的氣道炎癥的確切分子機制仍有待闡明。已經證實信號傳導及轉錄激活蛋白4（STAT4）和STAT6的活化在Th0細胞沿Th1和Th2通路的分化中起關鍵作用[19]。STAT6信號通路主要由IL-4誘導，IL-4誘導STAT6轉位至細胞核，快速誘導 GATA-3的表達。GATA-3的表達是誘導轉錄因子c-MAF，是一種有效的IL-4基因特異性激活劑。這形成了IL-4誘導GATA轉錄因子3（GATA3）和Th2分化的正反饋回路[20]。而STAT4信號通路主要由IL-12誘導，STAT4的激活誘導 T-bet表達，T-bet通過染色質重構激活IFN-γ基因，分泌IFN-γ，增加IL12Rb2鏈的表達，進一步增強IL-12信號[21]。STAT4／6信號通路的失調參與變應性哮喘的發生，在變應性哮喘進展的控制中有重要作用，具有作為治療干預靶點的潛力。但本研究中未對七葉亭治療過敏性哮喘具體分子機制進行研究，將在后續研究中完善。

綜上所述，七葉亭能減輕過敏性哮喘小鼠氣道阻力和氣道炎癥，通過抑制IL-4、改善IFN-γ來調控Th1／Th2失衡，進而改善過敏性哮喘的進展，可作為過敏性哮喘患者的潛在免疫治療藥物，但仍需進一步研究七葉亭治療過敏性哮喘的分子機制。