反相高效液相色譜法測定滋腎育胎丸中金絲桃苷、毛蕊花糖苷和二苯乙烯苷含量

楊麗娟 ，張君娜，苗曉紅，辛 娜

（1.河北省石家莊市婦幼保健院產科，河北 石家莊 050000； 2.河北省石家莊市第四醫院藥劑科，河北 石家莊 050000； 3.河北省唐山市婦幼保健院產科，河北 唐山 063000）

滋腎育胎丸是由菟絲子、砂仁、熟地黃、杜仲、人參、桑寄生、阿膠（炒）、首烏、艾葉、巴戟天、白術、黨參、鹿角霜、枸杞子、續斷等15味藥材組方的中藥成方制劑，臨床用于治療脾腎兩虛、沖任不固所致滑胎，防治習慣性流產和先兆性流產[1-3]。方中菟絲子具有補益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉等功效[4-6]，熟地黃具有補血滋陰、益精填髓等功效[7-9]，杜仲具有補肝腎、強筋骨、安胎等功效[10-12]。其質量標準收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第16冊)》（WS3-B-3113-98），但僅對性狀、鑒別和檢查項作出規定，無含量測定項，無法更全面地控制滋腎育胎丸質量。方中菟絲子為君藥，杜仲為臣藥，熟地黃為佐藥，且3種藥材活性成分毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷均在紫外光區有較強吸收。本研究中采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法檢測中成藥滋腎育胎丸中金絲桃苷、毛蕊花糖苷和 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯 -2-O-β -D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）3種活性成分的含量[13-17]，旨在為藥品標準的完善提供技術參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-1260 INFINITY型高效液相色譜儀（包括在線脫氣機、G1313A自動進樣器、G1316C自動柱溫箱和G1315C二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司）；BSA 124S-CW型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；Multiskan Sky型紫外可見分光光度計（美國熱電公司）；Milli-Q Advantage A10型純水儀（美國密理博公司）；KQ-300TDE型高頻超聲波清洗儀（昆山舒美儀器公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

圖1 高效液相色譜圖

1.2 試藥

金絲桃苷對照品（批號為111521-201809，含量以94.9%計），毛蕊花糖苷對照品（批號為 111530-201713，含量以 92.5% 計），2，3，5，4′- 四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號為110844-201814，含量以91.0%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；滋腎育胎丸（廣州白云山中一藥業有限公司，規格為每瓶 60 g，批號分別為 S00015，ER00012，W00103）；磷酸、冰醋酸（優級純，國藥集團）；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Spherisorb ODS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5.0 μm）；檢測波長：346 nm；柱溫：27 ℃ ；流速：1.0 mL ／min；進樣量：15 μL；流動相：乙腈（A） -0.2%磷酸溶液（B，移取 2.0 mL磷酸至 1 000 mL容量瓶中，超聲5 min，放冷），梯度洗脫(0～6 min時12%A，6～22 min時12%A～48%A，22～30 min時48%A～80%A，30～31 min時 80%A～12%A，32～36 min時12%A)。

2.2 溶液制備

取金絲桃苷 26.34 mg、毛蕊花糖苷 27.03 mg、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯 -2-O-β-D-葡萄糖苷27.47 mg，精密稱定，置 25 mL容量瓶中，加 95%甲醇20 mL，超聲溶解，取出放冷，定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備溶液。精密移取對照品貯備溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加95%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取樣品適量，研缽研成細粉，過80目篩網，取細粉1.0 g，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加 95%甲醇 15 mL，超聲處理（功率 200 W，頻率 60 kHz）20 min，取出放冷，加95%甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。按處方制備方法和藥材配比比例，制備缺紫蘇子、熟地黃和杜仲藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液，按擬訂色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。結果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷峰分離良好，分離度均不低于1.5，理論板數和拖尾因子等均符合《中國藥典》要求，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：取2.2項下對照品貯備溶液適量，加入 95% 甲醇，得質量濃度分別為 0.04，0.10，4.00，8.00，16.00，32.00 μg ／mL 的系列標準溶液，按擬訂色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。以3種活性成分的質量濃度（X）為橫坐標、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表1。可見，毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷質量濃度在 0.04 ～32.0 μg／mL 范圍內與其峰面積線性關系良好。

表1 3種活性成分線性回歸方程、線性范圍及相關系數(n＝6)

穩定性試驗：取樣品（批號為S00015），依法制備供試品溶液，于室溫下放置 0，3，6，9，12，24 h 時，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，并根據色譜圖中3種活性成分峰面積計算 RSD。結果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷峰面積的 RSD分別為2.13%，1.02%，1.91%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為S00015）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣分析，記錄色譜圖，并計算 RSD。結果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷含量的 RSD 分別為 3.09% ，2.31% ，3.38%（n＝6），表明方法重復性良好。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖；按3種活性成分峰面積計算 RSD。結果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷峰面積的 RSD 分別為 1.64%，0.93%，1.37% （n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為S00015），研缽研成細粉，過 80 目篩網；取細粉 1.0 g，精密稱定，置20 mL容量瓶中，稱取6份，依照供試品溶液制備方法進行處理，得6份樣品加樣溶液；按擬訂色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖，計算3種活性成分加樣回收率。結果見表2。

表2 3種活性成分加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件分別進樣分析，采集色譜圖，根據峰面積計算含量。結果見表3。

表3 各批樣品中3種活性成分含量測定結果（mg／g）

3 討論

3.1 檢測波長優化

分別配制含毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷質量濃度為8 μg／mL的標準溶液，加95%甲醇溶解并定容，取上述標準溶液分別在190～400 nm波長范圍內掃描。結果毛蕊花糖苷、金絲桃苷和二苯乙烯苷分別在335，359，321 nm波長處有最大吸收；取對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄190～400 nm全波段譜圖，結果于346 nm波長處3種活性成分響應最佳，故選擇346 nm作為檢測波長。

3.2 流動相優化

曾選擇乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液和乙腈-0.4%磷酸溶液作為流動相體系，考察不同體系對3種活性成分分離和峰形的影響。按擬訂色譜條件分別選擇上述4種流動相體系，分別進樣對照品溶液、陰性對照品溶液和供試品溶液，采集色譜圖。結果選擇乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相體系時，3種活性成分完全分離，且各色譜峰峰形較好。故選擇其作為流動相體系。

3.3 色譜柱優化

曾選擇色譜柱 Waters sunfire C18，Agilent Zorbax XDB C18，Waters Spherisorb ODS C18和 Kromasil C18作為分離柱，考察不同色譜柱對3種活性成分分離情況的影響。結果以色譜柱Waters Spherisorb ODS C18作為分離柱時，3種活性成分完全分離，故選擇其作為分析柱。

3.4 提取條件優化

滋腎育胎丸由15味藥材加工而成，基質較復雜，選擇最佳的提取條件對消除基質干擾有重要作用。分別選擇甲醇和95%，90%，85%甲醇溶液時，考察對滋腎育胎丸中3種活性成分的提取效果，結果選擇95%甲醇溶液時提取效果最佳。確定提取溶劑后，分別考察超聲時間（10，15，20，25，30 min）和超聲功率（150，180，200，220，250 W）的影響，最終確定95%甲醇溶液作為提取溶劑，功率為200 W、時間為20 min為最佳提取條件。

3.5 方法評價

該方法前處理簡單，準確度高，重復性好，適用于滋腎育胎丸中成藥產品的質量控制，可為國家藥品標準的完善提供技術參考。