清肝化瘀顆粒對原發性肝癌模型大鼠Raf/MEK/ERK通路的影響▲

邊 倩 吳昭利 程丹丹 魏海梁 閆曙光 李京濤

(陜西中醫藥大學附屬醫院1 肝病二科，2 腫瘤一科，咸陽市 712000，電子郵箱：p234liuxue@163.com；3 陜西中醫藥大學中醫臨床醫學院，咸陽市 712046；4 陜西中醫藥大學附屬醫院普外科，咸陽市 712000；5 陜西中醫藥大學基礎醫學院，咸陽市 712046；6 陜西中醫藥大學附屬醫院肝病一科，咸陽市 712000)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，具有難預防、預后差及死亡率高等特點。在我國，肝癌發病率在所有腫瘤中高居第4位，其已成為我國人群主要死因之一[1]。目前原位性肝癌的病因和發病機制仍未明確，臨床研究表明肝癌發病是環境與飲食雙重因素作用的結果，其中肝炎病毒、黃曲霉素、亞硝胺類物質、微量元素等與肝癌的發生相關[2-4]。肝癌早期癥狀不明顯，大部分患者確診時已處于中晚期，甚至已發生其他器官的轉移，而不規范治療會縮短患者的生存期，因此開展規范治療對于患者的預后有重大意義。清肝化瘀顆粒藥性溫和，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，可以有效控制肝癌患者的病情，減輕病患的痛苦，提高患者生存質量，且臨床用藥副作用較小[5]。肝細胞癌變與細胞內信號通路失調相關，其中迅速加速纖維肉瘤蛋白(rapidly accelerated fibrosarcoma，Raf)/絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(mitogen-activated extracellular signal regulated-kinase，MEK)/細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號轉導通路與肝癌的發生發展密切相關[6-7]。本文探討清肝化瘀顆粒治療肝癌模型大鼠對Raf/MEK/ERK通路表達的影響，以進一步了解清肝化瘀顆粒治療肝癌的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取無特定病原體級健康雄性Wistar大鼠50只，體重200～220 g，由遼寧長生生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2018-0015。整個實驗過程中，大鼠均飼養于溫度為20℃～25℃、濕度為55%的動物房。本研究通過動物倫理委員會批準，符合道德倫理要求。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑：二甲苯(批號：20180724)購自上海朵生生物公司，無水乙醇(批號：20171106)和過氧化氫(批號：20161020)購自南京森貝伽生物公司；一步法快速免疫印跡試驗辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)試劑盒(兔)(批號:CW02029)、一步法快速免疫印跡試驗HRP試劑盒 (鼠) (批號:CW02030)均購自北京康為世紀生物科技有限公司；二氨基聯苯胺顯色試劑(批號：20180104)購自Solarbio公司，蘇木精染色液(批號：CS20170612)購自北京酷來博科技有限公司，TRIzol Reagent 總RNA提取試劑(批號：DP405-02)購自Invitrogen Fisher Scientific公司。清肝化瘀顆粒(批號：20170731)由中日友好醫院藥學部制劑室制備。

1.2.2 主要儀器：電泳儀(型號：DYY-6D)購自北京六一儀器廠，圖像分析軟件購自Adobe公司，實時熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500型)購自美國ABI公司，低溫高速離心機(型號：Centrifuge 5810R)購自上海高致精密儀器有限公司，紫外分光光度計(型號NanoDrop 2000)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及肝癌模型建立[8]：實驗大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為空白對照組、模型對照組、清肝化瘀顆粒低劑量組、清肝化瘀顆粒中劑量組和清肝化瘀顆粒高劑量組，每組10只。模型對照組和清肝化瘀顆粒各劑量組大鼠給予含2.5 g/L二乙基亞硝胺的滅菌食用水自由飲用，空白對照組大鼠給予滅菌食用水自由飲用，14周后停用，清肝化瘀顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠每天分別給予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg的清肝化瘀顆粒灌胃，空白對照組、模型對照組給予等量的生理鹽水灌胃，1次/d，連續灌胃2周。

1.3.2 肝組織形態學觀察：灌胃結束時，處死大鼠，取出各組大鼠肝臟組織5 g置于10%中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋、切片后，部分用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，觀察肝組織形態學變化。

1.3.3 免疫組化檢測：取各組大鼠肝組織標本切片脫蠟后用抗原修復，在過氧化氫中孵育10～15 min，再用山羊血清封閉，加入一抗(武漢戴安生物，批號：20170816)4℃孵育過夜后37℃復溫45 min，加入二抗(武漢戴安生物，批號：20181108)37℃孵育 30 min，加入二氨基聯苯胺顯色劑覆蓋組織，蘇木精復染1 min，脫水、透明、封片。使用IIP6.0軟件測定整體A值。

1.3.4 實時熒光定量PCR：處死大鼠后，取3 g大鼠肝組織剪碎勻漿后，利用TRIzol 法提取大鼠肝組織總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA純度。使用反轉錄試劑盒(上海博湖生物科技有限公司，批號：CW03028)將總RNA反轉錄成cDNA。以β-肌動蛋白為內參照標準進行實時熒光定量PCR，反應體系為20 μL，包括10×SYBR Green PCR溶液10 μL，引物(5 pmol/L)1 μL，模板1 μL，滅菌雙蒸水8 μL。反應條件為50℃孵育2 min，然后95℃ 2 min；40個循環，95℃，15 s；60℃，1 min。采用 2-ΔΔCt法計算Raf mRNA、MEK mRNA和ERK mRNA 相對表達量。

1.3.5 免疫印跡試驗檢測：處死大鼠后，取3 g大鼠肝組織剪碎勻漿后，加入適量RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白，利用二喹啉甲酸試劑盒(上海佰曄生物科技中心，批號：N1683-2)檢測蛋白濃度。將所得蛋白煮沸10 min使其變性后上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h，濕法轉膜45 min。加入5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜后，加入一抗溶液孵育，4℃過夜，TBST洗膜后，二抗溶液室溫孵育2 h。在凝膠成像系統中進行曝光，使用Image J軟件檢測條帶灰度值。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠肝臟組織形態學觀察 鏡下可見空白對照組(圖1A)大鼠肝組織結構正常，肝細胞索排列整齊，細胞膜完整，胞核清晰。與空白對照組比較，模型對照組(圖1B)可見腫瘤細胞，細胞密度較大，肝細胞索排列紊亂，核質比大，核染色深，伴炎性細胞浸潤等病理特征，提示肝癌大鼠模型建模成功。

空白對照組 模型對照組

圖1 大鼠肝臟組織形態(HE染色，×200)

2.2 5組大鼠Raf、MEK和ERK的A值比較 與B組比較，其他4組大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK的A值升高；M組和H組低于C組，且M組低于H組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝組織中Raf、MEK和ERK的A值比較(x±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05。

2.3 5組大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，其余4組大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表達水平升高，清肝化瘀顆粒中劑量組和清肝化瘀顆粒高劑量組低于模型對照組，且清肝化瘀顆粒中劑量組低于清肝化瘀顆粒高劑量組(均P<0.05)。見表2及圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK蛋白表達水平

表2 5組大鼠Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白相對表達水平比較(x±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05。

3 討 論

近年來，中國肝癌的發病率和病死率具有逐年上升趨勢[1]，給社會發展和公共健康帶來極大的負擔。肝癌的治療主要以手術、放療和化療為主，雖然取得一定成果，但患者預后仍較差，生存率仍未欠滿意。有研究證實，Raf/MEK/ERK信號通路與腫瘤發生發展密切相關，該通路活化異常可導致腫瘤發生。例如Zhou等[9]發現，抑制Raf/MEK/ERK信號通路的活化可誘導人骨肉瘤細胞凋亡，阻滯G2/M細胞周期生長，并抑制細胞遷移及侵襲；Zhang等[10]認為下調Raf/MEK/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路表達，可抑制膠質母細胞瘤細胞增殖；Zhu等[11]發現肝癌細胞的增殖、分化、轉移等與Raf/MEK/ERK信號轉導通路密切相關。Raf、MEK和ERK都是人體內常見的蛋白激酶，其中Raf被激活后其C端催化區與MEK結合激活MEK，而活化的MEK通過N端區域與ERK直接連接進一步激活ERK。三者在Raf/MEK/ERK通路中發揮重要的作用，測定Raf、MEK和ERK蛋白表達水平可反映出Raf/MEK/ERK通路活化情況。

清肝化瘀顆粒主要成分包括苦參、黃芪、白術、白花蛇舌草、義術、三棱、半枝蓮、甘草等。苦參主要藥用成分為苦參素，研究顯示苦參素抑制肝內炎癥反應和肝內纖維組織增生，具有免疫調控、抗炎和抗纖維化功能[12]。黃芪多糖與枸杞多糖聯用對四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用[13]。白術通過抑制核因子E2相關因子2/抗氧化反應元件信號通路的活化，從而改善大鼠肝臟脂肪代謝紊亂，減輕肝臟脂質蓄積[14]。甘草總黃酮具有抗硫代乙酰胺誘導大鼠慢性肝纖維化的作用[15]。白花蛇舌草提取物通過抑制相關炎癥因子的表達，調節固有免疫系統的平衡而起到改善肝損傷的作用[16]。以上研究表明，清肝化瘀顆粒具有肝組織保護的藥效。

本研究采用飲用含二乙基亞硝胺的滅菌水建立肝癌大鼠模型，組織病理學提示成功建立肝癌大鼠模型。本研究結果顯示，肝癌大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表達水平升高，給予中、高劑量的清肝化瘀顆粒干預后，上述mRNA及蛋白表達水平均降低，且中劑量效果更為明顯，提示一定劑量的清肝化瘀顆粒對Raf/MEK/ERK通路具有抑制作用。清肝化瘀顆粒是由不同成分的中藥組成，其抑制Raf/MEK/ERK通路的活性成分仍不明確，需要進一步進行其他成分實驗研究或Meta分析才可驗證其作用機制。

綜上所述，清肝化瘀顆粒可通過抑制Raf/MEK/ERK信號通路，這或是其發揮抗腫瘤作用的機制之一。