高效液相色譜法測定丁細牙痛膠囊中丁香酚和細辛脂素含量

陳驍勇

（江蘇省鹽城市第一人民醫院，江蘇 鹽城 224000）

丁細牙痛膠囊由丁香葉和細辛組方，具有清熱解毒、疏風止痛的功效，對慢性牙髓炎具有較好療效[1]。現行質量標準采用供試品在酸性條件下與亞硝鈉-鉬酸鈉反應，以原兒茶酸為對照，采用紫外分光光度法測定其中丁香葉的含量[2]，而對細辛及丁香葉中丁香酚無測定方法。丁香葉中所含丁香酚具有廣譜抗菌消炎作用[3]，細辛所含細辛脂素具有祛風止痛功效，可用于治療牙痛[4]。參考文獻[5-9]，采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定丁香葉和細辛中的丁香酚和細辛脂素的含量，能更好地控制丁細牙痛膠囊的質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器

島津LC-20A型高效液相色譜儀（島津企業管理 ＜中國＞有限公司）；XP26型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為百萬分之一）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；Merck Milli-Q Advantage A10 型純水機（德國Merck Millipore公司）。

1.2 試藥

丁細牙痛膠囊（深圳市泰康制藥有限公司，批號分別為 20170903，20180312，180316，20180502，180907，規格為每粒0.45 g）；丁香酚對照品（批號為110725-201213，含量為 99.7% ），細辛脂素對照品（批號為111889-201504，含量為 100.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為純水儀自制去離子水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak MG ⅡC18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），按表 1 進行梯度洗脫；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流速：1 mL／min；檢測波長：287 nm。

2.2 溶液制備

分別取丁香酚對照品10.70 mg、細辛脂素對照品19.25mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。精密量取2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取樣品（批號為20170903）20粒，混合均勻，取2 g，精密稱定，加甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率為 500 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，作為供試品溶液。根據產品處方的用量比例，分別配制陰性對照品溶液、缺細辛陰性對照品溶液、缺丁香葉陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，缺細辛陰性對照品溶液、缺丁香葉陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果主成分峰分離度良好，與雜質能得到很好分離，原輔料均無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密吸取上述對照品貯備液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取5 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，以質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得丁香酚的回歸方程 Y丁＝5.4×104X丁+19 656（r＝0.999 9），細辛脂素的回歸方程 Y細＝5.8×104X細+54 205（r＝0.999 9）。結果表明，丁香酚和細辛脂 素 質 量 濃 度 分 別 在 5.334 ～ 64.008 μg／mL 和9.625～115.500μg／mL范圍內與其峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取樣品（批號為20170903）適量，依法制備供試品溶液，每次10 μL，重復進樣6次，記錄色譜圖。結果峰面積的 RSD丁香酚為 0.97%（n＝6），細辛脂素為0.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為20170903）適量，依法制備供試品溶液 10 μL，分別于 0，2，4，8，12，24 h時進樣測定峰面積。結果丁香酚、細辛脂素的 RSD分別為 1.57%和 1.31%（n＝6），表明供試品溶液在 24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20170903），按2.2項下方法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件測定。結果丁香酚平均含量為 1.19 mg／g、RSD為1.87% （n ＝6），細辛脂素平均含量為 2.22 mg／g、RSD為1.61%（n＝6），表明方法重復性良好。

圖1 高效液相色譜圖

加樣回收試驗：取同一批（批號為20170903）已知含量的供試品6份，每份1.0 g，分別加入對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定含量，并計算回收率。結果見表2。

2.4 樣品含量測定

取5批樣品，依法制備供試品溶液，分別測定含量。結果見表3。

表2 加樣回收試驗結果（n＝6）

表3 樣品含量測定結果（mg／g）

3 討論

試驗中對對照品混合溶液進行光譜掃描，發現丁香酚吸收波長為283 nm、細辛酯素最大吸收波長為287 nm，根據樣品中2個主成分的含量、峰面積及其他物質的影響，確定檢測波長為287 nm。

前處理過程中，分別用甲醇、稀乙醇處理樣品，結果甲醇處理后得到的樣品雜質最少，有效成分也提取完全。試驗中分別采用甲醇-水、乙腈-水為流動相，以甲醇-水為流動相時，細辛脂素峰形較差，且出峰時間長；以乙腈-水為流動相時，峰形尖銳對稱。考慮到丁香酚和細辛脂素出峰時間相差較大，故采用梯度洗脫法。