葡萄糖酸鋅口服溶液中5-羥甲基糠醛限量檢查

李 玲，王秋實

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222006）

5-羥甲基糠醛（5-HMF）是葡萄糖、果糖等單糖在高溫、酸性條件或微生物的作用下脫水生成的醛類化合物，對人體橫紋肌和內臟有損害，具有神經毒性，能與人體蛋白質結合產生蓄積中毒[1-2]，還有遺傳毒性、致癌性和致突變性[3]。葡萄糖酸鋅口服溶液適用于小兒厭食癥、皮膚痤瘡、口腔潰瘍、兒童生長發育遲緩等缺鋅性疾病，其質量標準收載于2015年版《中國藥典（二部）》[4]1276，但并未對雜質進行控制。葡萄糖酸鋅合成的起始原料主要為葡萄糖，且口服溶液輔料中含有較多蔗糖，特別在高溫滅菌過程中[5]，極易產生糖的降解產物5-HMF。2015年版《中國藥典(二部)》對以葡萄糖為載體的注射液均進行 5-HMF 的控制[4]215，380，489，1290，且 2015 年版《中國藥典(一部)》對藥用蜂蜜進行了5-HMF的控制[6]。本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法對葡萄糖酸鋅口服溶液中雜質5-HMF進行限量檢查，為提高本品質量標準提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型HPLC儀，包括2998PDA檢測器，Empower色譜工作站(美國Waters有限公司）；SartoriusBP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

5-HMF對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111626-201610，純度為 99.2%）；葡萄糖酸鋅口服溶液（廠家和批號見表1，規格為0.35%）；乙腈和甲酸均為色譜純；水為超純水。

表1 8批葡萄糖酸鋅口服溶液的廠家及批號

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.1% 甲酸（8 ∶92，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：284 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取5-HMF對照品10.12 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水振搖使溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，作為對照品溶液。取本品5 mL，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水振搖使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

量取上述空白溶劑、對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定。結果溶劑不干擾測定，5-HMF與相鄰雜質均能完全分離，專屬性良好，理論板數按5-HMF峰計不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 破壞性試驗

量取樣品（批號為20180904）5 mL，共5份，分別進行酸破壞（加 0.2 mol／L 鹽酸溶液 2 mL，室溫放置 4 h，加0.2 mol／L氫氧化鈉溶液2 mL中和，用水定容至10 mL），堿破壞（加 0.2 mol／L氫氧化鈉溶液 2 mL，室溫放置4 h，加 0.2 mol／L 鹽酸溶液 2 mL 中和，用水定容至10 mL），氧化破壞（加3%過氧化氫溶液5 mL，室溫放置 4 h），光照破壞（置 4 500 lx，24 h，定容至 10 mL），高溫加熱（90℃水浴4 h，放冷至室溫，定容至10 mL）。分別取上述破壞溶液20 μL，進樣測定，結果5-HMF色譜峰與上述破壞樣品中相鄰成分峰分離良好，破壞樣品中產生的雜質對5-HMF的測定無干擾。其中，5-HMF在堿和光照破壞條件下降解嚴重，穩定性差；在氧化條件下略有降解；在酸破壞條件下穩定性良好，基本無降解。結果見圖2。

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖

2.5 方法學考察

線性關系考察：分別精密量取2.2項下對照品貯備液各適量，用水稀釋成質量濃度分別為 0.2，1，4，10，20，40 μg／mL的系列線性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，以對照品質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝144 134 X-23 253，r＝0.999 8(n＝6)。結果表明，5-HMF 質量濃度在0.202～40.480 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

穩定性試驗：取供試品溶液（批號為20180904），分別于 0，2，8，12，18，24 h 時進樣測定，記錄色譜圖。結果5-HMF峰面積的 RSD為 1.16%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

精密度試驗：取對照品溶液，連續進樣6次，測定5-HMF 峰面積。結果的 RSD 為 0.69% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20180904）6份，按2.2項下方法平行制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果 5-HMF 含量平均值為 30.6 μg／mL，RSD為0.86%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20180904）9份，精密量取 5 mL，分別置 20 mL容量瓶中，平均分成3組，分別精密加入對照品貯備液1，1.5，2 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，計算加樣回收率。結果見表2。

表2 5-HMF加樣回收試驗結果（n＝9）

檢測限和定量限確定：精密量取5-HMF對照品溶液適量，加水逐步稀釋，進樣，根據信噪比（S／N）為3和10分別確定檢測限和定量限，結果檢測限和定量限分別為 1.0 ng 和 4.0 ng。

2.6 樣品含量測定

取 8 批(批號分別為 20190406，20180904，181113，180950，18120833，181104，20181206，180906)樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，按擬訂色譜條件進行測定，并按外標法計算含量。結果前7批樣 品 中 5-HMF 分 別 為 1.95，30.56，39.14，39.25，0.70，3.77，41.46 μg／mL，僅批號為 180906 的樣品中未檢出。

3 討論

3.1 提取方法選擇

5-HMF易溶于甲醇、乙醇和水，曾比較甲醇、50%甲醇和水作為提取溶劑的差異，結果3種溶劑均能達到充分提取的效果。考慮到成本及安全問題，結果選擇水作為提取溶劑，且雜質較少。同時，考察超聲時間（0，5，10 min）對提取效率的影響，結果制備供試品溶液不需要超聲，適當振搖即可提取完全。

3.2 檢測結果分析

共收集銷售較好的6個廠家共8批次的樣品，試驗結果表明，8批樣品中 5-HMF 含量在 0.70～41.46 μg／mL 范圍，其中有1批未檢出5-HMF，最高質量濃度與最低質量濃度相差近60倍?？梢?，目前市售葡萄糖酸鋅口服溶液質量參差不齊，部分廠家在生產工藝、儲存、質量控制等方面仍不完善。為保證成品質量，應重點考察工藝合理性，制訂規范化的生產過程及合理的質量控制指標。

3.3 應用價值

葡萄糖酸鋅口服溶液兒童及成人的口服劑量范圍為 10～40 mL／d，其中 5-HMF的質量濃度范圍為0.70 ～ 41.46 μg／mL，日暴露量則為 7.0 μg ～1.66 mg。對比以下 3種情況：1）2015年版《中國藥典（二部）》對葡萄糖注射液、以葡萄糖為載體的注射液均規定了5-HMF的限量，經折算，日最大暴露量分別為1.75 mg（臨床常用規格為5%）和5 mg[3]，本試驗中樣品中5-HMF含量均在允許范圍內；2）2015年版《中國藥典（一部）》對蜂蜜規定了5-HMF的限量，經折算，日最大暴露量為1.2 mg[3]，本研究中有4批樣品均超過日最大暴露量限度；3)5-HMF屬2類遺傳毒性雜質，限度的制訂需按遺傳毒性雜質要求進行，最理想的限度是5-HMF的日暴露量為1.5 μg[3]，本試驗中有7批樣品中5-HMF的含量遠超過毒理學閾值（TTC）限度的要求，存在安全隱患，但TTC是一個高度保守的暴露量，控制指標過于嚴格會導致生產成本增加和生產工藝的難度。由于葡萄糖酸鋅口服溶液屬口服制劑，故參考蜂蜜的5-HMF日最大暴露量來制訂本品的質控限度，經折算，將毒性雜質5-HMF限度定為應不得過30 μg／mL。建議本品質量標準增加5-HMF檢查項，建議部分廠家完善生產工藝，提高產品質量，以保證臨床用藥安全性。葡萄糖酸鋅口服溶液臨床廣泛應用于兒童，故控制遺傳毒性雜質5-HMF的限量具有重要臨床意義。