高效液相色譜法篩查利肺片中南五味子代替五味子

張永萍，李永鵬

（1.青海省海東市食品藥品和質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，青海 海東 810600； 2.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，青海 西寧 810000）

五味子為木蘭科植物五味子 Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱北五味子，而南五味子為木蘭科植物華中五味子 Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)[1]。南北五味子功效相似，但來(lái)源不同，且五味子市場(chǎng)價(jià)格明顯高于南五味子，一般認(rèn)為五味子的品質(zhì)優(yōu)于南五味子。利肺片處方規(guī)定投料為五味子，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中以兩者共有成分五味子甲素為鑒別指標(biāo)，難以反映投料情況[2]。南五味子中五味子酯甲含量遠(yuǎn)高于五味子[3-5]。本研究中對(duì)利肺片五味子藥材的投料情況進(jìn)行篩查，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定利肺片中五味子醇甲和五味子酯甲的含量[6-10]，并以五味子酯甲峰面積和五味子醇甲峰面積的比值(R值)判斷產(chǎn)品是否有南五味子投料。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)沃特世公司）；Milli-QA10型超純水器（德國(guó)默克密理博公司）；BSA224SCW型電子天平（賽多利斯公司，精度為十萬(wàn)分之一）；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化機(jī)械株式會(huì)社）；KQ-500DE型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為 20 kHz）。

1.2 試藥

五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)為110857-200406），五味子酯甲對(duì)照品（批號(hào)為111529-200503），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，默克公司）；水為Milli-Q純化水；37批利肺片（14個(gè)廠家，共37批次）均由2017年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)抽樣所得；利肺片模擬制劑（自購(gòu)藥材，經(jīng)檢驗(yàn)符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，按處方工藝提取所得）；五味子和南五味子藥材各10批，自購(gòu)藥材，經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院劉亞蓉主任藥師鑒定為木蘭科五味子 Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，南五味子為木蘭科華中五味子 Schiscandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)，符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：依利特 C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí) 30%A，10～65 min時(shí) 30%A→80%A，65～70 min時(shí)80%A→95%A，70～75 min時(shí) 95%A→15%A）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)不低于3 000。

2.2 溶液制備

取五味子醇甲與五味子酯甲對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為 28.4 μg／mL 和 40.1 μg／mL的混合對(duì)照品溶液。取樣品20片，除去包衣，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別取五味子藥材粉末、南五味子藥材粉末各1 g，精密稱定，分別置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得藥材溶液。按利肺片處方比例和工藝制備不含五味子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2，5，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，五味子醇甲為 Y醇＝2 083 329.785 7 X醇+15 733.935 2（r＝ 0.998 7），五味子酯甲為 Y酯＝1 571 706.640 2 X酯+16 799.543 3（r＝0.999 0）。結(jié)果表明，五味子醇甲和五味子酯甲質(zhì)量濃度分別在 0.056 8 ～ 0.568 0 μg 和 0.080 2 ～0.802 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算峰面積。結(jié)果五味子醇甲平均峰面積為580 572、RSD為0.74% （n＝6），五味子酯甲平均峰面積為 634 112、RSD為0.72%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（吉林百姓堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)為 20150901）適量，依法制備供試品溶液，于 0，4，8，12，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果五味子醇甲平均峰面積為 710 018、RSD 為 0.92（n＝6），五味子酯甲平均峰面積為84489、RSD為0.79%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（吉林百姓堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20150901）6份，依法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果五味子醇甲含量為 0.724 7 mg／g、 RSD 為 0.60（n ＝6），五味子酯甲含量為 0.102 7 mg／g、RSD 為 1.81% （n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（吉林百姓堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)為 20150901，五味子醇甲含量為0.721 6 mg ／g，五味子酯甲含量為 0.102 2 mg ／g）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入五味子醇甲對(duì)照品溶液（360 μg／mL）和五味子酯甲對(duì)照品溶液（52 μg ／mL）0.8，1.0，1.2 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 R值測(cè)定及評(píng)價(jià)

分別取五味子藥材和南五味子藥材各10批，依法制備藥材溶液；分別取五味子投料模擬制劑和南五味子投料模擬制劑各10批，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別記錄五味子酯甲和五味子醇甲的峰面積，計(jì)算R值。藥材和模擬制劑的R值分布圖見圖2。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果五味子、南五味子的R值分別為 0.025～0.043 和 16.516～32.115；利肺片五味子投料和南五味子投料模擬制劑的R值分別為0.011～0.040 和 19.260～29.995。方差分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，五味子和南五味子R值有顯著性差異（P＜0.006）。因此，R＜0.10可作為五味子和南五味子在利肺片中投料的鑒別依據(jù)。結(jié)果顯示，14個(gè)企業(yè)37批次利肺片樣品R值在 0.007 ～0.099 之間，均小于 0.10。可見，樣品基本不存在以價(jià)格比較低廉的南五味子代替五味子投料現(xiàn)象。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

圖2 藥材和模擬制劑的R值分布圖

2.5 含量測(cè)定及結(jié)果評(píng)價(jià)

對(duì)37批次樣品分別進(jìn)行五味子醇甲和五味子酯甲含量測(cè)定，結(jié)果見表2。可見，不同批次的五味子醇甲和五味子酯甲含量有一定差異。五味子醇甲含量范圍為0.424 7 ～1.490 2 mg／g，平均 0.789 6 mg／g；五味子酯甲含量范圍為 0.0014 ～0.0666 mg／g，平均 0.0261mg／g。

3 討論

試驗(yàn)中使用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)五味子醇甲與五味子酯甲波長(zhǎng)在（250±2）nm范圍內(nèi)均有最大吸收。故選擇250 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 37批次樣品中2個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

流動(dòng)相優(yōu)化時(shí)分別考察了甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，最終以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)色譜分離度好，故選擇此流動(dòng)相。

分別考察了甲醇、80%甲醇、乙酸乙酯，結(jié)果表明，以甲醇為溶劑提取效果較好，故以甲醇為溶劑。

分別比較了超聲處理15，30，60 min 3個(gè)提取時(shí)間。結(jié)果表明，15 min提取的含量低于提取30 min和60 min，且后兩者含量基本相同，故確定提取時(shí)間為30 min。

綜上所述，該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于利肺片中南北五味子投料的篩查和2種成分的含量測(cè)定。