高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法同時(shí)測(cè)定化瘀祛斑膠囊中4種柴胡皂苷含量

王麗方 ，劉 煒

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038； 2.臨床合理用藥生物特征譜學(xué)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038； 3.臨床合理用藥生物特征譜學(xué)評(píng)價(jià)國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100038）

化瘀祛斑膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收錄于2015年版《中國藥典（一部）》，其由柴胡、薄荷、黃芩、當(dāng)歸、紅花、赤芍 6味藥材經(jīng)過提取精制而成，具有疏風(fēng)清熱、活血化瘀的功效，主要用于風(fēng)熱瘀阻產(chǎn)生的黃褐斑、酒 等癥狀[1-3]。方中柴胡疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣，為君藥，且與該藥的藥理作用一致，柴胡皂苷為柴胡疏風(fēng)散熱、解郁的主要有效成分[4-7]。目前，柴胡的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅有薄層色譜鑒別，而無定量控制。2015年版《中國藥典(一部)》柴胡藥材項(xiàng)下以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為指標(biāo)成分進(jìn)行含量控制，但兩者均不穩(wěn)定，在煎煮和制劑過程中均易分解，分別產(chǎn)生柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2，且其次生皂苷也具有較好的生物活性[8-10]。目前，關(guān)于化瘀祛斑膠囊的研究主要集中在臨床研究[11-12]、黃芩苷含量測(cè)定[13-14]及多組分的含量測(cè)定[15-16]，尚未見柴胡皂苷含量測(cè)定報(bào)道。參考文獻(xiàn)[17]，本研究中以柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2和柴胡皂苷d作為控制化瘀祛斑膠囊中柴胡的指標(biāo)成分，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法同時(shí)測(cè)定4種柴胡皂苷含量，為全面提高化瘀祛斑膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括2424ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，Empower3色譜工作站(Waters公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為 300 W，頻率為 40 kHz）；XPE204型電子天平（美國梅特勒多利多公司，精度為十萬分之一）。

圖1 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法色譜圖

1.2 試藥

柴胡皂苷a對(duì)照品（批號(hào)為110777-201912，含量為 94.8%），柴胡皂苷 d對(duì)照品（批號(hào)為 110778-201912，含量為96.3%），均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；柴胡皂苷 b1對(duì)照品（批號(hào)為DST180519-009，含量為 98.0%），柴胡皂苷 b2對(duì)照品（批號(hào)為 DST170330-010，含量為 99.0% ），均購自成都曼斯特生物技術(shù)有限公司；柴胡藥材（陜西興德中藥飲片公司，批號(hào)為80301），經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)王煒主任藥師鑒定為傘形料柴胡 Bupleurum Chinese DC.的干燥根（習(xí)稱北柴胡）；化瘀祛斑膠囊（山西仁源堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為 20181002，20181105，20181203，規(guī)格為每粒 0.32 g）；氮?dú)猓兌炔坏陀?99.999% ），乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Bonus-RP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫，0～18 min時(shí) 38%A，18～32 min時(shí) 38% ～41%A，32～40min時(shí) 41%A，40～56mi時(shí) 41% ～52%A，56～59min時(shí)52% ～90%A，59～69 min 時(shí) 90%A；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃；漂移管溫度：42℃；載氣：氮?dú)猓魉伲?.5 mL ／min；進(jìn)樣量：10，20 μL。

2.2 溶液制備

取柴胡皂苷a對(duì)照品8.02 mg、柴胡皂苷b1對(duì)照品8.15 mg、柴胡皂苷 d 對(duì)照品 8.88 mg，精密稱定，置同一20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液Ⅰ；另取柴胡皂苷b2對(duì)照品2.61 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，精密加入上述對(duì)照品貯備溶液Ⅰ2 mL，置上述同一5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為5號(hào)混合對(duì)照品溶液。然后采用逐級(jí)稀釋法分別制備系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，記為1～4號(hào)混合對(duì)照品溶液。取樣品（批號(hào)為20181002）10粒內(nèi)容物，研勻，取0.5 g，精密稱取，置具塞錐形瓶中，精密加入5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為 240 W，頻率為 40 kHz）30 min，取出放涼，加5%濃氨試液的甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用 0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺柴胡藥材的陰性樣品，依法制備陰性對(duì)照藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，色譜圖見圖1。結(jié)果陰性對(duì)照藥材溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上未見色譜峰，表明處方中其余藥味對(duì)4種柴胡皂苷的含量測(cè)定無干擾。

線性關(guān)系考察：精密吸取上述1～5號(hào)混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，各進(jìn)樣2次，進(jìn)樣量為20 μL，以峰面積平均值的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y）、進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 4種柴胡皂苷的線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取上述1，3，5號(hào)低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積，各進(jìn)樣6次。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷 d 的 RSD 分別為 0.36% ，0.42% ，0.23%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20181002），依法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積，并按照兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算含量。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷 b1、柴胡皂苷 d含量的 RSD分別為 0.71%，0.56%，0.38%，0.65%（n＝6）。表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20181002），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，8，16，20，24 h時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷 b1、柴胡皂苷 d的 RSD分別為 1.96%，1.35%，2.01%，2.28%（n ＝6），表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取柴胡皂苷b15.38 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，作為待加溶液，另分別取柴胡皂苷a 4.62 mg、柴胡皂苷b28.65 mg和柴胡皂苷 d 5.49 mg，精密稱定，置同一 10 mL容量瓶中，精密吸取上述柴胡皂苷b1待加溶液2 mL，置上述同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為待加對(duì)照品的混合溶液。取樣品（批號(hào)為20181002）0.25 g，共6份，加入上述待加對(duì)照品混合溶液1 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 4種柴胡皂苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，平行制備3份，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 供試品制備方法選擇

參考《中國藥典(一部)》柴胡項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，采用 L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)氨水甲醇的體積分?jǐn)?shù)（3%，5%，7% ）、超聲功率（180 W，240 W，300 W）和超聲時(shí)間（20 min，30 min，40 min）進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，超聲頻率及時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果無顯著性影響，氨水甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果有顯著性影響。綜合考慮，選擇5%氨水甲醇作為提取溶劑，超聲處理(功率為240 W)30 min，為供試品的最佳提取制備工藝。

表3 3批樣品中4種柴胡皂苷含量測(cè)定結(jié)果(mg／g)

3.2 檢測(cè)器條件選擇

預(yù)試驗(yàn)中采用紫外檢測(cè)器測(cè)定4種皂苷，由于皂苷類均是末端吸收，干擾峰較多，通過調(diào)整流動(dòng)相和更換不同廠家色譜柱均未能使其分離。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d主要是環(huán)氧醚型柴胡皂苷，柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2是異環(huán)雙烯型柴胡皂苷，含有共軛雙烯結(jié)構(gòu)[10]，與柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的最大吸收具有一定差異，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其難以分離。由于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是通用質(zhì)量型檢測(cè)器，且對(duì)皂苷類具有較好的響應(yīng)。綜合考慮，采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的漂移管溫度進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)漂移管溫度升高至80℃以上時(shí)，峰面積會(huì)急劇減小，且峰形不對(duì)稱、分離度不好，可能是由于溫度過高導(dǎo)致樣品溶劑揮發(fā)時(shí)帶走部分對(duì)照品，影響樣品的測(cè)定結(jié)果。綜合考慮，選擇漂移管溫度為42℃，色譜峰分離良好，峰形良好，無干擾。

3.3 系統(tǒng)適用性考察

曾考察不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL ／min）、不同柱溫（20，25，30，35，40 ℃）、不同漂移管溫度（38，40，42，44，46℃）及 3種不同廠家的色譜柱（Agilent Zorbax Bonus-RP C18柱，Welch Ulitimate XB C18柱，Waters XBridge C18柱），結(jié)果顯示，在上述色譜條件范圍內(nèi)，樣品中4種柴胡皂苷的色譜峰分離良好、理論板數(shù)高，對(duì)稱因子在0.95～1.05之間，且峰形對(duì)稱。不同廠家色譜柱均能分離4種柴胡皂苷色譜峰，故此方法可用于化瘀祛斑膠囊中4種柴胡皂苷的含量測(cè)定。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的HPLC-ELSD法可同時(shí)測(cè)定化瘀祛斑膠囊中4種柴胡皂苷的含量，3批樣品中均檢出柴胡皂苷b2和柴胡皂苷b1，且含量差異不大，可推斷出在制劑和生產(chǎn)中存在柴胡皂苷b2和柴胡皂苷b1，因此有必要對(duì)其作為指標(biāo)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制。該方法具有操作簡單、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，4種柴胡皂苷作為化瘀祛斑膠囊中柴胡的特征性成分，用于其質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制，可為提高和改進(jìn)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。