重組人干擾素 -2b相關蛋白檢測和質量分析

張伶俐 ，劉 冰 ，楊惠潔 ，王夢瑩 ，陶 磊 ，饒春明

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121； 2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

重組人干擾素（rhIFN）為全球第二大重組蛋白藥物[1]，我國現有10多個廠家生產。2015年版《中國藥典（三部）》[2]采用分子排阻色譜（SEC）和凝膠電泳（SDSPAGE）來控制原液中的雜質含量，未收載相關蛋白的檢測項目，而《歐洲藥典》[3]及《日本藥典》[4]均收載反相高效液相色譜法（RP-HPLC）檢測相關蛋白項目，其中以《歐洲藥典》使用范圍最廣。為提高我國生物制品標準，并與國際標準達到一致，本研究中采用9.0版《歐洲藥典》中的方法，進行了色譜柱驗證和方法確認，并對相關廠家重組人干擾素α-2b原液進行了相關蛋白檢測和質量分析。為進一步完善該制品的質量標準提供依據，同時為今后該制品的監督管理提供參考?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：1260型液相色譜儀（包括 DAD檢測器，Agilent公司）；Jupiter-C18柱（Phenomenex 公司），Zorbax 300SB-C18柱（Agilent公司），XBridge BEH300-C18柱（Waters公司），以上色譜柱規格均為（250 mm×4.6 mm，5μm）。液相色譜串聯質譜，色譜儀 WatersAcquity UPLC H-Class，色 譜柱 Waters Acquity BEH300 C4柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm），Triple TOF 5600 型質譜儀(美國AB Sciex公司)，數據分析軟件BioPharmaView。

試藥：重組人干擾素α-2b原液（A廠家2批，B廠家3批，C廠家3批，D廠家5批，E、F、G廠家各3批，H廠家1批）；三氟乙酸、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.2 溶液制備

供試品溶液：供試品為來自國內8個廠家生產的23批重組人干擾素α-2b原液，取適量注射用水稀釋至 1 mg／mL。

參比品溶液：取供試品溶液適量，加入適量的0.25%（m／m）過氧化氫溶液，使過氧化氫終濃度為0.05% （m ／m），室溫放置 1 h，每 1 mL 溶液中加入L-甲硫氨酸 12.5 mg，室溫放置 1 h。

1.3 試驗方法

色譜條件、系統適用性試驗及判定標準：流動相為0.2%三氟乙酸30% 乙腈溶液（A）-0.2%三氟乙酸80%乙腈溶液（B），線性洗脫程序(0 min時 28%B，1 min時28%B，5 min時 33%B，20 min時 37%B，30 min時 43%B，40 min時 60%B，42 min時 60%B，50 min 時 28%B)；流速為 1.0 mL／min；檢測波長為 210 nm；柱溫為室溫；進樣體積為50 μL。氧化峰與主峰的分離度不小于1.0，即為系統適用性試驗合格。主峰保留時間約為20 min，氧化型峰的保留時間為主峰的0.9倍，在主峰保留時間的0.7～1.4間積分，單個雜質峰面積不得大于總積分面積的3.0%，各雜質峰面積的和不得大于總面積的5.0%。

液相色譜串聯質譜：超高效液相色譜柱溫：室溫；質譜離子源為ESI源；質譜采集模式為TOF MS；掃描范圍為 700～3 000 m／z；掃描時間為 1 s；離子源溫度為350℃；噴霧電壓為5 500 V；DP電壓為200 V。

2 結果

2.1 色譜柱驗證

采用終濃度為0.05%（m／m）的過氧化氫處理目的蛋白質誘導氧化，制成參比品溶液。3種不同C18柱的色譜圖顯示，氧化干擾素保留時間與主峰保留時間之比均為0.9，主峰理論板數為2 800～3 000，氧化型峰與主峰的分離度約為 1.0，除某公司的 1根色譜柱略低（0.97）外，其他均滿足系統適用性試驗要求（見圖 1）。

圖1 不同型號色譜柱高效液相色譜圖

2.2 供試品色譜圖及色譜峰成分

選用滿足系統適用性試驗要求的色譜柱進行供試

品溶液的檢測。在主峰保留時間0.9處檢出氧化型峰（見圖2）。根據一級譜圖計算得到主峰的相對分子質量為19 265.2，與理論分子質量偏差在1內。氧化型峰通過去卷積計算得到其完整相對分子量為19 281.7，比主峰分子量約大16。通過肽圖分析，檢測到第16位甲硫氨酸位點發生氧化。色譜圖顯示，主峰有單峰和雙峰2種形式，質譜解析單峰為IFNα-2b，雙峰為IFNα-2b和 IFNα-2b+Met；其相應氧化型分別為 IFNα-2b+16 Da和 IFNα -2b+16 Da，IFNα -2b+Met+16 Da。

圖2 重組人干擾素 -2b相關蛋白反相高效液相色譜圖及質譜解析

2.3 供試品相關蛋白質量分析

結果見表 1。按1.3項下判定標準，8個廠家23批供試品中，3個廠家的7批供試品不符合規定，且單個雜質峰面積和各雜質峰面積的和這2個限值同時超標，未出現僅有1個限值不符合規定的情況。供試品不合格率為30.43%，不合格廠家數占總數的37.50%。雖然2家公司的C18柱色譜峰分離度有區別，但實際檢測結果相似（見圖3）。

表1 重組人干擾素 -2b相關蛋白檢測結果

3 討論

大部分生物技術類制品是由活的生物體合成，存在固有程度的結構異質性；另外，在生產、原材料和／或產品貯存過程中也會產生異質性。生物技術類制品純度分析理念經從主藥成分轉變到相關物質和雜質分析，說明分析方法的選擇和優化主要應考慮因素為預期產品與產品相關物質和雜質的分離。另外，生物技術產品和生物制品的絕對純度難以測得，對測定方法有一定的挑戰性，且所得結果與所用方法密切相關。因此，國際人用藥品注冊技術協調會(ICH)協調三方指南Q6A和Q6B指導原則中指出，純度一般應采用多種方法綜合評估。應盡量根據蛋白質不同的理化特性，選擇原理不同的多種檢測方法，相互補充進行分析。

圖3 重組人干擾素 -2b相關蛋白檢測結果

當重組蛋白發生氧化、脫酰胺、異構化、成鹽、末端氨基酸降解、二硫鍵錯配等化學性改變時，分子量無或僅有很微小的變化，使用分子排阻色譜或凝膠電泳難以分離[5-7]。本研究中按 9.0版《歐洲藥典》規定，利用RP-HPLC法檢測重組人干擾素α-2b的相關蛋白，可操作性、重復性和實用性均良好，但需注意色譜柱的系統適用性。

研究證實，我國大部分重組人干擾素α-2b原液中含有氧化型峰。蛋白質氧化是由活性氧誘導的氨基酸的化學性共價修飾，可能降低蛋白質生物活性，促進蛋白分子聚集，增加免疫原性，促進蛋白水解等[8-10]。按《歐洲藥典》判定標準進行質量分析，供試品不合格率為30.43%。其中，3個廠家的所有批次均不符合規定，但未出現某個廠家某個別批次不符合規定的情況，表明與供試品的生產工藝密切相關。同時，對同一批樣品不同時間的穩定性考察中發現，氧化型峰成分可能隨時間的延長而增加。因此，監測蛋白質氧化在生物制藥行業中對于制造、表征和質量控制變得至關重要。

本研究中70%的產品符合規定，表明我國重組人干擾素大部分產品的質量均符合國際先進標準要求。建議將重組人干擾素的RP-HPLC法相關蛋白檢測納入下一版《中國藥典》。部分廠家應改進生產工藝，提高產品質量。既適合目前我國國情，又可使我國標準與國際標準接軌，以整體提高我國重組人干擾素的質量水平，并對其他重組制品質量標準提高也起到一定導向作用。