番茄紅素對膿毒癥大鼠免疫及炎性因子的影響

王 涵，伍志超

（四川省南充市中心醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000）

膿毒癥是由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS），發(fā)病率高，病死率高，進一步發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能不全綜合征（MODS），進而危及生命[1-2]。免疫細胞功能紊亂和炎性細胞因子失衡在膿毒血癥器官損傷中扮演重要角色，并影響預(yù)后[3]。番茄紅素具有清除自由基、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫細胞活化和細胞因子分泌等多種藥理活性[4]，可減輕膿毒血癥大鼠心肌纖維損傷，維持內(nèi)皮系統(tǒng)平衡[5]。本研究中探討了番茄紅素對膿毒癥大鼠免疫及炎性細胞因子的影響，為臨床治療膿毒癥提供實驗依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：T12MM型離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；Gallios型流式細胞儀（中國貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；乙醇（北京華阜康生物科技股份有限公司）；二甲苯（湖北廣奧生物科技有限公司）；蘇木素、伊紅（上海源葉生物科技有限公司）；中性樹膠封片劑（美國National Diagnotics公司）；Ni Ci E100 E200型顯微鏡（上海千欣儀器有限公司）；IL-6測定試劑盒(北京冬歌生物科技有限公司)；TNF-α測定試劑盒(深圳市科潤達生物工程有限公司)；MDA測定試劑盒(上海創(chuàng)賽科技有限公司)；SOD測定試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)。

試藥：戊巴比妥鈉（天津興隆化學(xué)制藥廠）；生理鹽水（江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司）；內(nèi)毒素（上海甄準生物科技有限公司）。

動物：SD大鼠30只，SPF級，健康，雄性，周齡8～10周，體質(zhì)量（280±20）g，購于上海靈暢生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0003。喂養(yǎng)于動物實驗室獨立通氣籠中（每籠5只），室溫維持在22～25℃，相對濕度維持在50% ～60%，所有大鼠每天接受12 h光照，采用同種無菌飼料投喂，不限制飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 分組、造模及處理

將30只SD大鼠分為對照組、模型組、處理組，每組10只。各組大鼠腹腔注射45 mg／kg戊巴比妥鈉予以麻醉，處理組尾靜脈注射50 mg／kg番茄紅素[5]，對照組及模型組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，2 h后模型組及處理組大鼠腹腔注射20 mg／kg內(nèi)毒素（上海甄準生物科技有限公司），對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模成功標準參照文獻[5]。

1.3 觀察指標

白細胞介素 6（IL-6）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平：注射 6 h后采集各組大鼠外周靜脈血4 mL，置T12MM型離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司），3 000 r／min離心20 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組大鼠血清中的IL-6和TNF-α含量，采用硫代巴比妥酸法檢測血清MDA水平，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平。

免疫細胞數(shù)量：采集3組大鼠外周血各2 mL，用肝素抗凝，采用流式細胞儀檢測外周血中 CD3+，CD8+，CD4+T細胞百分比。

肺組織病理變化：3組大鼠采血后，將其處死，取肺組織，10%甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋成塊，切成5 μm連續(xù)切片，脫蠟水化，蘇木素染色，流水沖洗，伊紅染色，流水沖洗，烤片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片劑封片，顯微鏡觀察蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。各組大鼠外周血中 CD3+，CD8+，CD4+T 細胞百分比及 IL-6，TNF-α，SOD，MDA水平比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化

對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡間隔正常，肺間質(zhì)無充血水腫，無中性粒細胞浸潤；模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增寬，肺間質(zhì)有明顯充血水腫，部分肺不張，有大量中性粒細胞浸潤；處理組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)充血水腫明顯改善，中性粒細胞浸潤明顯減少。模型組較對照組肺組織病理損傷明顯，處理組較模型組肺組織病理改善明顯。詳見圖1。

2.2 外周血檢測指標

結(jié)果見表1。

圖1 3組大鼠肺組織病理變化（HE染色，×200）

表1 3組大鼠外周血中免疫細胞數(shù)量、炎性因子含量、SOD及MDA水平比較（±s，n＝10）

表1 3組大鼠外周血中免疫細胞數(shù)量、炎性因子含量、SOD及MDA水平比較（±s，n＝10）

注：與對照組相比， P ＜0.05；與模型組相比， P ＜0.05。

組別對照組模型組處理組C D 3+T細胞（%）3 7.2 5 ± 6.9 8 2 7.0 9 ± 6.0 2 3 4.1 2 ± 6.1 3 C D 4+T細胞(%)1 9.8 8 ± 1.4 5 2 5.3 2 ± 2.0 5 2 2.1 1 ± 1.8 7 C D 8+T細胞(%)1 6.7 7 ± 6.6 5 1 0.2 3 ± 4.8 6 1 4.4 6 ± 5.5 6 I L-6(n g／m L)2 6.3 8 ± 2.3 1 3 3.0 2 ± 3.0 5 2 8.1 1 ± 2.5 2 T N F- (n g／m L)1 9 5.7 0 ±1 0.9 7 2 3 0.8 9 ±1 8.4 5 2 0 1.3 2 ±1 1.0 9 S O D（U ／m L）1 8 3.5 5 ± 1 3.5 7 1 3 2.1 9 ± 1 0.2 3 1 6 8.1 2 ± 1 2.4 1 M D A（n m o l／m L）4.1 1 ± 0.7 0 1 0.8 3 ± 1.6 8 7.2 2 ± 1.3 1

3 討論

膿毒癥為重癥監(jiān)護病房常見危重癥，常見于多發(fā)傷、嚴重?zé)齻⒅匕Y肺炎、外科手術(shù)等患者，也可見于再生障礙性貧血、白血病、糖尿病、慢性阻塞性支氣管炎、尿路結(jié)石等慢性疾病患者[6]。70%的膿毒癥患者早期表現(xiàn)為意識狀態(tài)改變、低血壓、組織灌注不良等休克癥狀，隨著病情進展可導(dǎo)致MODS[2]。全身炎性反應(yīng)與代償性抗炎反應(yīng)協(xié)調(diào)失衡是發(fā)病的核心機制[3]，故尋找一種能有效調(diào)節(jié)免疫細胞和炎性細胞因子失衡的物質(zhì)對于控制膿毒癥病情具有重要意義。

番茄紅素是一種天然的紅色開鏈烴類胡蘿卜素，由11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵組成，目前主要通過植物提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵獲得，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、提高免疫力、保護心腦血管等作用[4]。番茄紅素與急性心肌梗死及心源性猝死相關(guān)[7]；能修復(fù)受損衰老的胰島細胞，促使胰島素正常分泌[8]；能增強小鼠單核巨噬細胞作用及體液免疫和細胞免疫功能[9]。

T淋巴細胞亞群測定有助于了解機體免疫狀況及病情監(jiān)測，CD3+反映總T細胞，通過鹽橋與T細胞抗原受體相連，進而參與T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]；CD4+主要表達于輔助T細胞，輔助T細胞免疫效應(yīng)，誘導(dǎo)B淋巴細胞分化產(chǎn)生抗體，調(diào)節(jié)殺傷淋巴細胞、自然殺傷細胞等活性[11]；CD8+主要為細胞毒T細胞亞群，主要分布于抑制性和殺傷性T淋巴細胞表面，抑制B淋巴細胞功能，還對細胞內(nèi)寄生生物感染的靶細胞有殺傷作用[12]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，處理組大鼠外周血中CD4+T細胞百分比顯著降低，CD3+，CD8+T細胞百分比顯著升高，表明番茄紅素在膿毒癥發(fā)病過程中對機體免疫功能異常改變的作用不明顯，這可能是由于番茄紅素在大鼠體內(nèi)作用時間較短，其作用尚未體現(xiàn)的原因。

IL-6和TNF-α為誘導(dǎo)機體炎性反應(yīng)的重要炎性因子，在炎癥發(fā)生時，其在血液中的水平迅速發(fā)生改變。TNF-α是一種單核因子，主要產(chǎn)生于巨噬細胞，具有參與局部炎癥、殺傷靶細胞、調(diào)控內(nèi)皮細胞活化、促進細胞凋亡的作用[13]。IL-6是由活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子，能增強NK細胞裂解功能，使B細胞前體成為產(chǎn)生抗體的細胞[14-15]。本研究結(jié)果顯示，處理組大鼠外周血中IL-6及TNF-α水平均顯著低于模型組；處理組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡間隔、肺間質(zhì)充血水腫、中性粒細胞浸潤較模型組均有明顯改善，表明番茄紅素能有效降低炎性細胞因子水平，減輕膿毒癥大鼠肺組織病理損傷。

膿毒血癥釋放的內(nèi)毒素可增加活性氧及自由基產(chǎn)生，而活性氧及自由基產(chǎn)生是膿毒血癥致肺損傷的重要環(huán)節(jié)。同時，內(nèi)毒素引起的炎性反應(yīng)可誘發(fā)氧化應(yīng)激，可進一步加強炎性反應(yīng)，從而使免疫細胞比例紊亂和炎性細胞因子失衡得不到控制[5]。因此，提高機體抗氧化能力有助于改善機體炎癥。本研究結(jié)果顯示，處理組大鼠外周血中MDA水平顯著低于模型組，但SOD水平顯著高于模型組，表明抗氧化作用最強的類胡蘿卜素-番茄紅素可有效降低內(nèi)毒素引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低炎性反應(yīng)，并減輕組織損傷。

綜上所述，番茄紅素能有效降低膿毒癥大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎性細胞因子產(chǎn)生，減輕肺組織病理損傷，但其在膿毒癥發(fā)病過程中對機體免疫功能異常改變的作用不明顯，且番茄紅素為預(yù)先注入大鼠體內(nèi)，因此番茄紅素在膿毒癥發(fā)病過程中對機體免疫功能的作用機制有待進一步研究。