鹽酸戊乙奎醚誘導早期生長反應蛋白1的表達及其對人血管平滑肌細胞的增殖作用

陳 曦，胡婷婷，史惠卿，劉小娟，李 楠

（中國人民解放軍西部戰區總醫院，四川 成都 610083）

早期生長反應蛋白 1（EGR1）屬即刻早期基因家族、編碼cys2-his2型鋅指蛋白，廣泛表達于從酵母到人類的真核細胞中[1]。作為轉錄因子的EGR1，能與多種下游基因的啟動子區域相結合，調控許多基因的表達，這些基因參與細胞增殖、分化、凋亡、缺氧反應等生物學效應[2-3]，有的甚至在腫瘤中發揮重要作用[4-5]。EGR1是表皮生長因子受體（EGFR）介導的腦室區神經干細胞和祖細胞在缺氧-低血糖恢復期擴增的關鍵調節因子[6]。DICKINSON等[7]的研究顯示，EGR1能促進血管表皮細胞的增殖，但EGR1通過何種基因影響細胞的增殖仍有待進一步研究。本研究中探討了EGR1在人類血管平滑肌細胞(CRL-1999)增殖過程中的作用及影響的下游基因，旨在揭示其在肺血管損傷修復中的作用提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

細胞株：CRL-1999購于ATCC。

試劑：F-12K營養混合物培養基，胎牛血清，均購自Gibco公司；抗人EGR1抗體（Santa公司）；抗人細胞周期調控蛋白D1（CCND1）抗體，抗人細胞外信號調節激酶 1／2（ERK1／2）抗體，抗人磷酸化的 ERK1／2（p-ERK1／2）抗體，均購自 CST公司；辣根氧化酶標記的山羊抗兔，山羊抗鼠二抗，均購自博奧生物公司）；RIPA裂解液；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒，5% ～20%梯度預制膠，電泳液，轉膜液及蛋白彩色預染MARKER、ECL化學發光試劑盒，均購自碧云天公司；逆轉錄試劑盒，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRTPCR）試劑盒，均購自日本Takara公司；慢病毒購自吉凱生物公司；EDU檢測試劑盒（iClickTM EdU Andy Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit，廣東復能基因有限公司)。

儀器：7500型 Real-Time PCR System PCR儀（美國ABI公司）；Fluor Chem型凝膠成像化學發光系統（美國Protein Simple公司）；Gallios型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.2 方法

細胞培養：取CRL-1999細胞，置含10%胎牛血清的F-12K營養混合物培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養。

細胞慢病毒干擾實驗：取10×104個／孔對數期生長的細胞，置12孔板中，過夜貼壁培養。按感染復數(MOI)為30的量加入慢病毒，培養12 h后，換成新鮮的培養基繼續培養36 h，然后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

qRT-PCR：采用Trizol法分別提取siEGR1-CRL-1999細胞和對照細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，用SYBR PCR試劑盒在7500型Real-Time PCR System RCR儀上進行qRT-PCR檢測（預變性，95 ℃ 30 s，然后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個循環），設置 3個復孔。PCR引物：ACTIN，正向引物 5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，反向引物 5′-GTAGTTTC GTGGATGCCACAG-3′；EGR1，正向引物 5′-CAGCAC CTTCAACCCTCAG-3′，反向引物 5′-CACAAGGTGTT GCCACTGTT-3′；CCND1，正向引物 5′-TATTGCGCTGCTACCGTTGA-3′，反向引物 5′-CCAATAGCAGCAA ACAATGTGAAA-3′。

蛋白質印跡（WB）法檢測 EGR1，CCND1，ERK1 ／2和p-ERK1／2蛋白表達：采用RIPA裂解液法提取細胞總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，沸水煮5 min使蛋白變性；蛋白上樣量為40 μg，以5%～20% 梯度膠電泳分離蛋白質；濕轉法轉移蛋白至聚偏乙烯（PVDF）膜，5%BSA封閉1 h，加入一抗4℃過夜（EGR1 1 ∶1 000，ACTIN 1 ∶2 000，CCND1 1 ∶1 000，ERK1 ／2 1 ∶1 000，p-ERK1 ／2 1 ∶1 000），二抗室溫孵育 1 h（山羊抗鼠 1∶5 000，山羊抗兔 1∶5 000），采用ECL化學發光法顯示結果。

EDU法檢測細胞增殖：分別用胰酶消化對照組細胞和 siEGR1-CRL-1999細胞，計數，2×105個 ／孔接種于6孔板內，37℃過夜培養，棄培養基，每孔加入2 mL含 10 μmol／mL EDU 的培養液，37 ℃，CO2培養箱中繼續培養6 h，按試劑盒說明處理細胞，采用流式細胞儀分析。

鹽酸戊乙奎醚處理細胞：將CRL-1999細胞和siEGR1-CRL-1999細胞按 5×105個／孔接種于 6孔板中，培養過夜，然后加入鹽酸戊乙奎醚，并設空白對照組，最終質量濃度為2 μg／mL。放入培養箱中培養，并于0，0.5，1，2，4，8 h 時取材備用。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件分析。計量資料（正態分布）以±s表示，組內兩兩比較行 t檢驗；采用相關性分析采用Pearson相關分析，r＜0.3為低度正相關，0.3≤r＜0.7 為中度正相關，0.7≤ r＜ 1.0 為高度正相關；統計圖表采用GraphPad Prism 6繪制。P＜0.01為差異有顯著統計學意義，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒對CRL-1999細胞中EGR1表達水平的影響

細胞轉染EGR1干擾慢病毒48 h后，熒光顯微鏡下觀察發現，大部分細胞都表現出明顯的綠色熒光（見圖1 A），表明細胞轉染了慢病毒，并整合到基因組上，成功構建siEGR1-CRL-1999細胞。qRT-PCR結果顯示，EGR1被成功干擾（見圖 1 B，P ＜0.01）。同時，WB 實驗結果表明，EGR1蛋白表達水平也明顯降低（見圖1 C）。

圖1 慢病毒對CRL-1999細胞中EGR1表達水平的影響

2.2 敲低EGR1表達對CRL-1999細胞增殖的影響

將EDU加入siEGR1-CRL-1999細胞或對照組細胞中，培養6 h后，陰性對照組中26%的細胞含有EDU，即26%的細胞進入了S期；同時，siEGR1-CRL-1999細胞中只有19%的細胞含有EDU，其增殖效率減少了 27% （見圖 2，P ＜ 0.01）。表明干擾 EGR1 后，CRL-1999細胞增殖受到了明顯抑制。

圖2 敲低EGR1表達對CRL-1999細胞增殖的影響

2.3 敲低EGR1表達對CCND1表達水平的影響

敲低 EGR1后，qRT-PCR結果表明，CCND1的表達相應降低（見圖 3A，***P ＝0.0003，**P ＝0.001 1）。WB實驗也表明，敲低CRL-1999細胞的EGR1后，CCND1蛋白表達水平明顯降低（見圖3 B）。

圖3 敲低EGR1表達對CCND1表達水平的影響

2.4 鹽酸戊乙奎醚對EGR1表達水平的影響

對CRL-1999細胞進行鹽酸戊乙奎醚處理，分別在 0 h（處理前），及處理后 0.5，1，2，4，8 h 時提取蛋白質，進行WB檢測，發現處理1 h后EGR1蛋白表達開始增多，2 h時達頂點，一直持續到8 h時（見圖4 A），表明鹽酸戊乙奎醚能誘導CRL-1999細胞的EGR1表達。為了進一步驗證，對siEGR1-CRL-1999細胞和CRL-1999細胞同時進行鹽酸戊乙奎醚處理，并進行WB檢測。處理4 h后，鹽酸戊乙奎醚處理組的CRL-1999細胞和 siEGR1-CRL-1999 細胞的（b，d）EGR1 蛋白表達量均比未處理組（a，c）增多，且藥物誘導后的siEGR1-CRL-1999細胞（d）的EGR1蛋白表達量顯著低于CRL-1999細胞（b），進一步表明鹽酸戊乙奎醚能誘導CRL-1999細胞的EGR1表達（見圖4 B）。

圖4 鹽酸戊乙奎醚對EGR1表達水平的影響

2.5 鹽酸戊乙奎醚可通過ERK1／2通路刺激EGR1表達

對2.4項下不同時間點提取的蛋白質中p-ERK1／2，ERK1／2和EGR1蛋白的表達水平進行檢測，結果顯示，p-ERK1／2在鹽酸戊乙奎醚處理1 h后表達水平達峰值，維持至2 h時，隨后逐漸減少。而EGR1的表達在1 h時僅輕微增多，后逐漸增多，其蛋白水平表達變化在時間上總落后于 p-ERK1／2（見圖5），提示鹽酸戊乙奎醚可通過ERK1／2通路誘導EGR1的表達。

圖5 加入鹽酸戊乙奎醚后，不同時間點p-ERK1／2，EGR1蛋白表達水平

3 討論

通常血管平滑肌細胞在動脈中膜中維持非增殖狀態，但在損傷或其他刺激下，中膜的血管平滑肌細胞會遷移到內膜，開始增殖并分泌細胞外基質，導致動脈內膜擴張，即新內膜形成[8]。富含絲／精氨酸剪輯因子1（SRSF1）能通過 Δ133p53-EGR1復合體，影響KLF5的表達，從而促進血管平滑肌細胞的增殖[9]。XIE等[10]的研究發現，EGR-1參與了瘦素誘導的過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）的減少和肺動脈平滑肌細胞的增殖。SYSOL等[11]的研究發現，血小板源生長因子（PDGF）通過 EGR-1 誘導鞘氨醇激酶 1（SphK1）的表達，可促進肺動脈平滑肌細胞增殖。此外，在其他組織中，EGR1也起到了促進細胞增殖的作用，如肌肉衍生的衛星細胞[12]、小鼠肝臟細胞[13]等。EGR1除了能被生長因子誘導高表達外，也能被一些刺激誘導高表達，如缺氧、輻照等；缺氧情況下，會對肺動脈造成一定程度損傷，故進一步研究EGR1的功能，不但能在損傷修復階段起作用，而且在損傷防治階段也能起到一定作用。

阿魏酸通過缺氧上調EGR1來改善人肌腱衍生干細胞的自我更新和分化[14]。CHEN等[15]的研究結果證實，CCND1的轉錄是由EGR1直接調控的，CCND1是3種非連接蛋白（Cyclin D1，D2，D3）之一，在哺乳動物細胞周期中主要調控G1期向S期過渡。敲低CRL-1999細胞的EGR1后，會影響CCND1的表達，從而影響人血管平滑肌細胞CRL-1999的體外增殖。

鹽酸戊乙奎醚是我國自主研發的抗膽堿Ⅰ類新藥，有較強的抗M和N樣受體作用，對外周神經有較強的抗M樣作用和一定程度的抗N樣作用，臨床主要用于對抗有機磷的中毒和全身麻醉患者術前給藥。鹽酸戊乙奎醚能較早改善氧合，減緩急性肺損傷的進展，可應用于對創傷性急性肺損傷早期的干預治療[16]。鹽酸戊乙奎醚能抑制炎性反應，減輕肺組織的損傷，改善氧合，能有效緩解多發傷導致的急性肺損傷[17]，但其具體作用機制和通路仍不清楚。ZHANG等[18]的研究認為，在缺血再灌注誘導的急性肺損傷中，通過適當增加自噬可起到保護作用，同時 ERK1／2信號通路具有積極的調節作用。ERK1／2是20世紀80年代末期發現的一類絲／蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的一個重要亞族，正常定位于胞漿，當激活后轉位至胞核，調節轉錄因子活性，產生細胞效應。本研究中發現鹽酸戊乙奎醚能通過ERK1／2通路刺激EGR1的表達，但鹽酸戊乙奎醚通過EGR1影響血管平滑肌細胞的具體作用機制仍不清楚，有待進一步研究。