正交試驗設計優選茵陳蒿湯水煎煮工藝

沈 晗 ，黃玉宇 ， ，陳 汀 ，沈夕坤

（1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012； 2.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州 215009）

茵陳蒿湯源于《傷寒論》，由茵陳、梔子和大黃組方，常用于治療濕熱黃疸。方中茵陳苦寒，降泄、清肝膽濕熱，為君藥；梔子性寒，清三焦之火，為臣藥；大黃瀉熱通利，為佐藥[1]。三藥共用，通利二便，使黃疸漸消。茵陳中的綠原酸等成分及梔子中的梔子苷均有保肝利膽作用[2-5]；大黃中的大黃酸、大黃素等成分可作用于消化系統，對胰腺和肝臟有保護和修復作用。茵陳蒿湯具有利膽、護肝等作用，對于急性黃疸型肝炎、膽囊炎、膽石癥等療效良好[6-9]。茵陳蒿湯療效的顯著與否除與藥材質量有關外，其煎煮工藝也有影響。本研究中以浸泡時間、加水量和煎煮時間為影響因素，以浸膏得率和藥材主要成分的含量為衡量指標探討茵陳蒿湯的水煎煮工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AG285型電子分析天平（精度為萬分之一），AX26DR型電子天平（精度為百分之一），均購自瑞典梅特勒-托利多公司；KQ-300VDB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，雙頻為 45 Hz／80 Hz）；KDC-140R 型超速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Direct-Q3UV型超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 試藥

對照品綠原酸（批號為 110753-201415，純度為96.2% ），梔子苷（批號為 07499605），蘆薈大黃素（批號為 110795-201710，純度為 98.3% ），大黃酸（批號為110757-200206），大黃素（批號為 1110756-200110），大黃酚（批號為 110796-201319，純度為 99.6%），大黃素甲醚（批號為 110758-201616，純度為 99.0%），咖啡酸（批號為 110885-201703，純度為 99.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號為4974，純度為 98.0%），異綠原酸 B（批號為 3089，純度為 98%），均購自上海詩丹德生物技術有限公司；茵陳（批號為190216，產地為江蘇），梔子（批號為 181113），均購自蘇州市天靈飲片公司；大黃（批號為190517，產地為甘肅，蘇州市博源藥業有限公司)；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計

按處方比例，稱取5劑藥材，置不銹鋼鍋中煎煮，煎煮2次，煎煮液濃縮至300 mL。以浸泡時間（因素A）、加水量（因素B）、煎煮時間（因素C）和空白項（因素D）為考察因素，設計正交試驗。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

2.2 浸膏得率測定

取表1因素水平下制備的9份濃縮液50 mL，置已干燥至恒重的陶瓷蒸發皿中，于99.9℃水浴鍋上蒸干，再置105℃烘箱中干燥3 h后取出，放入干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱定質量，計算出膏率。

2.3 指標性成分含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：AgilentZorbaxEclipseXDB-C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A） -0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脫 (程序見表 2)；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254，327 nm；進樣量：5 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.3.2 溶液制備

對照品溶液：取梔子苷、新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、異綠原酸B、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、大黃素對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，制成質量濃度分別為 0.494 0，0.365 2，0.175 0，0.032 9，0.260 6，0.011 3，0.002 7，0.364 6，0.005 2，0.006 8 mg／mL 的混合溶液，即得。

表2 流動相梯度洗脫程序（%）

供試品溶液：取2.1項下制備的茵陳蒿湯水煎液9份，每份10 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入甲醇14 mL，超聲處理30 min，取出冷卻，加甲醇定容至刻度，離心，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得，編號為 S1～S9。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察：將2.3.2項下對照品溶液稀釋成不同梯度的溶液，按擬訂色譜條件進樣5 μL，以溶液質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表3。

表3 各成分線性關系考察結果

精密度試驗：依法取同一混合對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定6次。結果新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、異綠原酸B、蘆薈大黃素、大黃素甲醚大黃酸、大黃酚、大黃素峰面積的 RSD分別為1.18% ，0.50% ，1.15% ，0.65% ，1.13% ，0.22% ，0.86% ，2.30% ，3.90% ，2.70%(n ＝ 6)，表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

重復性試驗：依法平行制備6份S9供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、異綠原酸B、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、大黃素峰面積的 RSD分別為 0.59%，0.60% ， 0.53% ，0.28% ，1.73% ，0.38% ，2.14% ，2.30%，3.64%，1.49%(n ＝ 6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗：依法制備 S9供試品溶液，于 0，3，6，9，16，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定。結果新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、梔子苷、異綠原酸B、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、大黃素峰面積的 RSD分別為0.70% ， 0.62% ，1.30% ，0.22% ，1.34% ，0.30% ，0.93% ，2.47% ，2.32% ，1.43%(n ＝6)，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：依法平行制備6份S9供試品溶液，每份1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加入等體積的混合對照品溶液，加甲醇定容至刻度。按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表4。

表4 加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 多指標成分加權分析

將總體設置為100分，由于茵陳和梔子在茵陳蒿湯中比例較高，故將新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B和梔子苷的含量權重系數均設置為10分；由于大黃素甲醚成分含量較少，大黃素甲醚在酸性或加熱條件下易發生水解而轉化成大黃素[10]。故將游離蒽醌類成分作為一個總體，其含有量權重系數設置為20分；由于浸膏代表整個方劑，將其權重系數設為30分。綜合評分 ＝10.0×新綠原酸含量／最大值+10.0×綠原酸含量／最大值+10.0×咖啡酸含量／最大值+10.0×異綠原酸B含量／最大值+10.0×梔子苷含量／最大值+20.0×總游離蒽醌含量／最大值+30.0×浸膏得率／最大值。結果見表5，方差分析見表6。可見，各因素對浸出物和指標性成分的影響度依次為A＞B＞C，即浸泡時間＞加水量＞煎煮時間；浸泡時間對結果影響最大，這可能是因為茵陳質地輕浮，易漂浮在水面，不易被水浸潤；又由于質地較疏松，有效成分會被快速煎出。故茵陳蒿湯的煎煮工藝確定為A3B3C2，即加18倍量水浸泡50 min后煎煮30 min。

2.5 最佳工藝驗證

按最佳煎煮工藝，同時煎煮3批茵陳蒿湯，將所得數據進行分析，結果3批茵陳蒿湯的綜合評分分別為98.51，98.63，97.71分，平均為98.28分。可見該煎煮工藝提取率高，且穩定可行。

表5 正交試驗設計及結果(n＝9)

表6 方差分析

3 討論

參照2015年版《中國藥典(一部)》給定的波長（梔子為 238 nm[11]248，大黃為 254 nm[11]23，茵陳為 327 nm[11]239）并結合二極管陣列檢測器的全波長掃描，結果在238 nm波長下出峰多，梔子苷含量高，但所測成分分離度不好，且咖啡酸成分在此波長下檢測不到；254 nm波長下，所測得大黃各成分分離度較好，且含量較高，梔子苷在此波長下含量也較高，且分離度較好，但咖啡酸含量檢測不到；327 nm波長下，新綠原酸、綠原酸、咖啡酸和異綠原酸B各成分含量高、分離度好、峰形好，但其他待測成分幾乎檢測不到。故選取254 nm和327 nm雙波長作為檢測波長。

通過正交試驗，最終確定了茵陳蒿湯的最佳水煎煮工藝，為茵陳蒿湯的煎煮提供了標準和質量保障。此外，還發現茵陳蒿湯加水量比一般方劑要多，這可能是因茵陳吸水系數較大，故對于含有草藥類的方劑應酌情添加水量。

中藥湯劑是中醫治療疾病的傳統劑型，是中醫臨床應用最廣泛的劑型，也是制備其他劑型的基礎。湯劑煎煮的好壞會直接影響疾病治療效果，故應嚴格把控中藥湯劑的煎煮工藝，在遵循相關煎煮規范的同時，應根據方劑中藥材的質地來確定其煎煮因素，并形成各自的煎煮規范標準。