金黃色葡萄球菌耐藥性分布特征及分子流行病學研究

叢萌倩

(青海大學附屬醫(yī)院檢驗科，青海西寧 810001)

金黃色葡萄球菌(SA)是環(huán)境中廣泛分布的一種革蘭陽性菌，通常定植于鼻黏膜、皮膚組織等皮膚表面，從而引起包括皮膚和軟組織在內(nèi)的局部化膿性感染，嚴重時也可引起心內(nèi)膜炎、腦膜炎、敗血癥、膿毒癥等全身感染，是導致院內(nèi)感染的重要致病菌[1]。伴隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)迅速擴散到世界各地。早期發(fā)現(xiàn)的MRSA菌株由于來源于住院患者，一般被稱為醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA)，其耐藥性是由于SA攜帶了可水平移動的耐藥元件葡萄球菌染色體mec基因盒(SCCmec)，隨著SCCmec的傳播，又出現(xiàn)了社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)[2]。根據(jù)中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2017年我國綜合性醫(yī)院檢出的MRSA在所有SA中的占比約為35.30%，且對青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星等臨床常見抗菌藥的耐藥性均在50.00%以上[3]。由于MRSA對多種抗菌藥物存在耐藥性，并且存在耐藥性從醫(yī)院向社區(qū)擴散的風險，控制MRSA醫(yī)院內(nèi)感染的形勢十分嚴峻。本研究對2015年1月至2017年12月本院臨床科室送檢樣本進行SA的檢測，并對其進行MRSA的判定及耐藥性分析，同時通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法檢測殺白細胞素(pvl)基因攜帶情況，以明確本院SA菌株中MRSA的流行情況和耐藥情況，從而為臨床合理使用抗菌藥物并有效控制MRSA傳播提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源

1.1.1臨床分離株 按照原衛(wèi)生部頒發(fā)的《醫(yī)院感染診斷標準(試行)》[4]，收集本院2015年1月至2017年12月所有臨床送檢樣本(包括住院患者和門診患者)中分離并進行鑒定的SA菌株，剔除重復菌株，同一患者只選取一株分離株進行分析。

1.1.2標準菌株 ATCC25923為SA標準株，ATCC43300為MRSA標準株，購自上海北諾生物科技有限公司，本實驗室保存。

1.2研究方法

1.2.1菌株鑒定 SA的鑒定根據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4版)的流程進行[5]；MRSA的鑒定采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2016版推薦的紙片擴散法(K-B法),篩選30 μg頭孢西丁藥片抑菌環(huán)直徑≤21 mm的菌株[6]，然后通過PCR擴增mecA基因，K-B法耐藥和mecA基因陽性的菌株判定為MRSA。

1.2.2藥敏試驗 根據(jù)CLSI 2016的K-B法[6]，檢測SA菌株對臨床常見10種抗菌藥物的藥物敏感性，檢測的抗菌藥物包括：青霉素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、慶大霉素、利福平、頭孢唑啉、復方磺胺甲噁唑、萬古霉素。

1.2.3DNA提取及基因檢測 總DNA提取采用煮沸法，挑取血平板上生長良好的SA單克隆，接種到200 μL TE緩沖液(pH 8.0，含15 U/mL溶葡球菌酶)配制為菌懸液，35 ℃水浴30 min后，沸水浴10 min，12 000 g離心5 min，收集含有細菌DNA的上清液，-20 ℃凍存?zhèn)溆茫徊捎肞CR檢測菌株攜帶pvl基因情況。PCR反應體系及引物參見徐銀海等[7]文獻報道。

1.3統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件和Microsoft Office Excel2000進行分析處理。分類資料采用構(gòu)成比表示，分類資料組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1SA菌株分布情況 2015年1月至2017年12月本院實驗室共收集SA臨床分離株441株，其中406株來源于住院患者，35株來源于門診患者。通過K-B法結(jié)合mecA基因擴增，結(jié)果見圖1。共檢出MRSA 147株，總檢出率為33.33%，其中住院患者樣本檢出145株，占住院患者樣本的35.71%，門診患者樣本檢出2株，占門診樣本的5.71%，住院患者的MRSA檢出率顯著高于門診患者的檢出率，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.05，P<0.001)。MRSA檢出情況按年分布結(jié)果見圖2，各組別各年份MRSA的檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2015年MRSA總檢出率為36.69%，其中住院患者樣本MRSA檢出率為39.84%，門診患者為0；2016年MRSA總檢出率為32.89%，住院患者樣本MRSA檢出率為35.25%，門診患者樣本MRSA檢出率為7.69%；2017年MRSA總檢出率為30.67%，住院患者樣本MRSA檢出率為32.37%，門診患者樣本MRSA檢出率為9.09%。

注：M為DNA標志物；N為陰性對照；P為陽性對照(310 bp)；1～4為檢測樣本，其中2為mecA陰性，其余為陽性。

圖1 mecA基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 2015-2017年MRSA菌株的檢出率

2.2SA菌株對抗菌藥的敏感率 對SA菌株進行常見10種抗菌藥物的敏感試驗，結(jié)果見表1。除萬古霉素以外，住院患者來源的SA菌株耐藥率普遍高于門診患者來源的SA菌株。無論是住院患者還是門診患者，分離到的SA菌株對青霉素都呈現(xiàn)普遍耐藥，耐藥率分別為100.00%和88.57%。住院患者來源的SA菌株對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、慶大霉素、頭孢唑啉的耐藥率均大于50.00%，而門診患者來源的SA菌株對以上藥物的耐藥率均未超過50.00%。所有SA菌株對利福平和復方磺胺甲噁唑的耐藥率均比較低，總體耐藥率分別為7.26%和12.02%，未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素有耐藥性的SA菌株。

表1 不同樣本來源SA菌株對常見抗菌藥的耐藥率[n(%)]

2.3SA菌株的毒力基因pvl攜帶情況及與耐藥的關系 應用PCR擴增pvl基因，共檢出28株SA攜帶pvl基因，總體攜帶率為6.35%(結(jié)果見圖3和表2)，其中21株來自于住院患者樣本(5.17%)，另外7株來自于門診患者樣本(20.00%)，門診患者來源的樣本pvl基因攜帶率明顯高于住院患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.91，P=0.001)。

注：M為DNA標志物；N為陰性對照；P為陽性對照(430 bp)；1～5為檢測樣本，其中2和3為pvl陽性，其余為陰性。

圖3 pvl基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 不同樣本來源SA菌株的pvl基因攜帶情況

注：a住院患者數(shù)據(jù)和門診患者數(shù)據(jù)進行比較。

SA菌株按照是否攜帶pvl基因，進一步分層分析其與抗菌藥耐藥的關系，結(jié)果見表3。pvl攜帶情況僅與復方磺胺甲噁唑的耐藥性相關，pvl“-”菌株的耐藥性略高(χ2=4.08，P=0.043)，pvl是否陽性與其他檢測抗菌藥藥物的耐藥性沒有顯著關聯(lián)。

表3 pvl基因攜帶與常見抗菌藥耐藥的關系[n(%)]

注：-表示未進行統(tǒng)計分析。

3 討 論

以MRSA為代表的耐藥SA感染，在使用抗菌藥物治療時極易取代敏感株變成流行株從而導致治療失敗，已經(jīng)成為臨床治療需要重視的問題。本研究對臨床樣本中SA菌株進行耐藥性檢驗，可以了解MRSA等耐藥菌株的流行趨勢，同時,為臨床的合理用藥、提高治療效率提供依據(jù)。

徐小玲等[8]對2012年1月至2012年12月國內(nèi)醫(yī)院MRSA感染率文獻進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)MRSA感染率為33.50%～92.61%。最近5年CHINET的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，MRSA的檢出率出現(xiàn)了持續(xù)下降，2017年34所醫(yī)院MRSA的檢出率在10.30%～62.10%[3,9-10]。本院MRSA檢出率從2014年的36.69%下降到30.67%，處于中間水平，雖然各年份之間差異無統(tǒng)計學意義，但是總體趨勢出現(xiàn)了下降，提示最近幾年醫(yī)院的MRSA防控工作有一定效果。本研究還發(fā)現(xiàn)MRSA檢出率與樣本來源有關，住院患者樣本的MRSA檢出率顯著高于門診患者樣本的MRSA檢出率，這應該與住院患者往往需長期使用抗菌藥物,且治療期間有侵入性操作相關，同時,住院時間較長和輾轉(zhuǎn)科室較多也是MRSA檢出率高的危險因素[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，住院患者樣本的SA菌株耐藥率普遍高于門診患者樣本，這與國內(nèi)外文獻報道一致[12-14]。住院患者樣本的SA耐藥株呈現(xiàn)出對青霉素的普遍耐藥，住院患者的SA菌株對阿莫西林和頭孢唑啉的耐藥率也高于50.00%，提示在臨床治療時對于住院患者出現(xiàn)SA感染，選擇β-內(nèi)酰胺類藥物的效果可能會很差，但是對于門診患者，還是可以選擇青霉素類之外的其他β-內(nèi)酰胺類藥物。研究中的SA菌株，對于紅霉素和克林霉素的耐藥率也比較高，所以臨床治療也應盡量不選擇大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類藥物。對于門診患者，其他抗菌藥的耐藥率均比較低，所以臨床治療的選擇比較多，但是住院患者的SA菌株還對左氧氟沙星和慶大霉素有較高的耐藥率，只對利福平、復方磺胺甲噁唑、萬古霉素普遍敏感。所以，對于住院患者SA感染的治療可選擇的藥物種類明顯減少。萬古霉素等糖肽類抗菌藥物是目前應對細菌感染的最后一道防線，雖然本研究未檢出對萬古霉素耐藥的SA菌株，但是研究發(fā)現(xiàn)MRSA比一般敏感菌株對萬古霉素的敏感性降低[15]，因此，臨床上更需重視菌株耐藥性的監(jiān)測。

pvl是SA菌株分泌的一種溶細胞毒素，可以作用于巨噬細胞和單核細胞，造成大量白細胞的損傷，從而導致死亡等嚴重的感染結(jié)局，是SA菌株毒力的重要來源[16]。目前研究表明，pvl基因與CA-MRSA感染存在相關性，通常認為攜帶pvl基因是CA-MRSA的重要特征[17]。本研究pvl攜帶率為6.35%，比葉千紅等[18]和楊穎等[19]報道的檢出率要低，而與曾云祥等[20]報道的檢出率接近，比國內(nèi)研究報道的檢出率要高[7,13,21]，這可能與地區(qū)差異有關。門診患者來源的SA菌株其pvl基因分離率顯著高于住院患者樣本的分離率，說明pvl基因主要來源為社區(qū)獲得，與目前已有[18]的報道一致。pvl+與pvl-的SA菌株對除復方磺胺甲噁唑以外的常見抗菌藥耐藥率沒有顯著差異，這與楊穎等的報道一致[19]。pvl-的SA菌株對復方磺胺甲噁唑的耐藥性略高，但是考慮到SA菌株對復方磺胺甲噁唑普遍敏感，且對復方磺胺甲噁唑耐藥的菌株總體數(shù)量較少，所以，臨床治療使用復方磺胺甲噁唑依然能取得較高的治療效果。值得注意的是，pvl攜帶情況雖然與抗菌藥耐藥沒有明顯關聯(lián)，但是因為pvl毒素與壞死性肺炎存在顯著相關，近年來關于pvl+的SA菌株感染導致死亡病例逐漸增加，因此，臨床還是需要重視對此類SA菌株的治療[22-23]。

4 討 論

本院臨床分離的SA菌株中MRSA檢出率在2015-2017年未見明顯變化，且pvl基因攜帶率較低，但對多種常見抗菌藥物有較高耐藥率，住院患者樣本的MRSA檢出率和耐藥率均高于門診患者，今后需要注意臨床合理用藥并加強對SA感染的監(jiān)測，有效控制耐藥株的產(chǎn)生和流行。