耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐藥分子學研究*

張曉慧，王瑞雪，高春艷，侯辰蕊，宋 靜，戎建榮

(山西醫學科學院·山西白求恩醫院檢驗科，山西太原 030032)

碳青霉烯類抗菌藥是治療多重耐藥腸桿菌科細菌(產ESBLs和/或產AmpC酶)導致的嚴重感染的選擇藥物[1]。但隨著碳青霉烯類抗菌藥的大量使用，耐碳青霉烯腸桿菌科細菌出現并逐漸增多，其中主要是耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)，嚴重威脅人類健康，給臨床治療重癥感染帶來嚴峻挑戰，也是當前研究的熱點。本研究對分離自本院的CRKP菌株進行了碳青霉烯酶的表型確證和產酶基因型(A、B、D類)的聚合酶鏈反應(PCR)擴增，并進行多位點序列分型(MLST)，對本院的CRKP流行特征和耐藥分子機制進行研究，為感染防控提供分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 從本院臨床微生物實驗室的感染患者標本中分離到1 906株肺炎克雷伯菌，篩選出CRKP 46株(2.40%)。質控菌株包括：大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705，肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706。

1.2儀器與試劑 主要儀器：Vitek-2 compact(法國Bio Merieux)，MALDI-TOF MS 質譜儀(美國Bruker，Microflex LT/SH)，PCR擴增儀(Eppendorf)，電泳儀(北京君意，JY300C)，凝膠成像儀(Alphalmager HP，Protein simple)；試劑： 血平板(鄭州安圖)，MH水解酪蛋白平板(天津金章)，引物等基因擴增試劑盒(賽默飛世爾科技中國有限公司)，亞胺培南和美羅培南紙片(Oxoid公司 )，DNA測序(上海生物工程公司)。

1.3方法

1.3.1菌種鑒定及藥敏試驗分析 根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)解釋分類標準，當亞胺培南或美羅培南MIC為2.0～4.0 μg/mL或厄他培南MIC為2.0 μg/mL時，懷疑腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶，需要作驗證試驗確證。因此，本研究采用亞胺培南MIC值≥2.0 μg/mL作為指標篩選CRKP菌株以免漏檢低耐藥株，同時檢測美羅培南和厄他培南的MIC。將待檢菌株血平板傳代后35 ℃孵育18～24 h，采用MALDI-TOF-MS進行菌株鑒定，藥敏試驗采用MIC 法(VITEK-2 compact)，紙片擴散(K-B)法復核，篩選出46株亞胺培南MIC≥2.0 μg/mL的肺炎克雷伯菌株。

1.3.2表型確證試驗

1.3.2.1改良Hodge試驗(MHT)[2，14]參照2017年CLSI解釋分類標準，將0.5麥氏單位的大腸埃希菌(ATCC25922)菌液1∶10稀釋后，均勻密涂在MH平皿上，中心貼美羅培南紙片，將待測菌株、陰性、陽性對照分別以中心美羅培南紙片為起點，沿半徑方向離心劃線，35 ℃孵育過夜，對碳青霉烯抗菌藥敏感的大腸埃希菌ATCC25922沿接種線條向含有碳青霉烯類抗菌藥紙片的方向生長即判斷為陽性。陽性對照(肺炎克雷伯菌ATCCBAA1705)，陰性對照(肺炎克雷伯菌ATCCBAA1706)。

1.3.2.2碳青霉烯酶滅活試驗[2](CIM) 參照CLSI標準，用接種環從孵育過夜的血平板上挑取一環待測菌落，溶于Ep管的生理鹽水中，漩渦振蕩混勻菌懸液，用無菌鑷子將美羅培南(10.0 μg)紙片浸入已混勻的菌懸液中(待測菌株、陽性對照、陰性對照)，再次漩渦混勻，置于35 ℃孵育4 h后取出，立即貼于已經均勻密涂0.5麥氏單位的大腸埃希菌(ATCC25922)的MH平板上，再次置于35 ℃溫箱，孵育18～24 h后觀察結果。陰陽性對照菌株同改良Hodge試驗。

1.4耐藥基因檢測

1.4.1PCR模板的制備 將46株實驗菌株純培養物，挑取一定量的新鮮菌落(18～24 h內)懸濁混勻于300.0 μL的去離子水中，沸水浴15 min后，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液作為模板，-80 ℃保存備用。引物稀釋前先12 000 r/min離心5 min后，加入等體積的去離子水，漩渦振蕩器混勻，作為儲存液。

1.4.2基因檢測 7對反應引物[3]和PCR擴增條件參照本課題前期研究[14]見表1；總反應體系25.0 μL，2×Mix 12.5 μL，引物1.0 μL，模板1.0 μL，dd水9.5 μL；KPC、IMP、SME、GES、VIM、OXA48-L基因的反應條件：94 ℃預變性5 min;進入循環：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s/50 ℃ 1 min (IMP)，72 ℃ 1 min，30個循環后于72 ℃延伸7 min；NDM基因的反應條件：95 ℃預變性5 min;進入循環：95 ℃ 1 min，57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環后于72 ℃延伸5 min；擴增產物采用1.50%瓊脂糖凝膠電泳并成像記錄結果。

1.5多位點序列分析(MLST) 所有CRKP菌株進行MLST分析，參照MLST專業網站[15](http://www.pasteur.fr/recherche /genopole/PF8/mlst /Kpneumoniae.html)對7個管家基因gapA、infB、mdh、pgi、rpoB、pheE和tonB進行PCR和測序。引物及反應條件參照巴斯德數據庫(http://bigsdb.web.pasteur.fr)。測序結果在肺炎克雷伯菌MLST數據庫(http://pubmlst.org/Klebsiella pneumoniae/)中進行BLAST 比對，確定其菌株ST型別。

2 結 果

2.1菌種鑒定及藥敏試驗

2.1.1菌種鑒定 歷時兩年收集本院臨床分離到肺炎克雷伯菌株1 906株，篩選出CRKP 50株，鑒定藥敏復核后，剔除敏感菌株4株，得到46株CRKP(2.40%)，標本主要類型為痰液(41.30%)、尿液(19.50%)、腹水(8.70%)、引流液(4.30%)、血液(2.00%)和其他(24.20%)；主要來源是重癥醫學科(16.00%)，普通外科、全科醫學科和神經外科(各10.80%)，老年醫學科(8.10%)，呼吸內科、腫瘤內科和消化內科(各5.40%)等。

2.1.2藥敏試驗結果統計 見表2。

2.2耐藥基因檢測結果 所有CRKP菌株，擴增陽性產酶基因型包括3種：KPC、NDM、IMP。基因測序結果顯示分別為KPC-2、NDM-1和IMP-4基因型見圖1、2、3。

2.3藥敏試驗 MHT對所篩選的菌株進行產碳青霉烯酶表型確證，46株CRE中，MHT(+)33株(71.70%)，見圖4。

2.4CIM試驗結果判讀 若美羅培南紙片的抑菌圈直徑為6～15 mm，則判斷待測菌株產碳青霉烯酶，若≥19 mm，則判斷待測菌株不產碳青霉烯酶，若抑菌圈直徑在16～18 mm，則不能確定是否產酶[3]。本次試驗結果顯示46株測試菌株均為陽性(100.00%)見圖5。

表1 引物序列及產物長度

圖1 KPC-2基因測序圖(部分)

圖2 NDM-1基因測序圖(部分)

圖3 IMP-4基因測序圖(部分)

注：+表示陽性對照，-表示陰性對照。

圖4 MHT結果(3、5號均為陽性標本)

注：+表示陽性對照，-表示陰性對照。

圖5 CIM試驗結果(3、5號均為陽性標本)

2.5MLST序列分型結果 MLST分型結果顯示：46株CRKP包括8種ST型別，ST11型有33株，占71.70%，為最常見型別。其次，ST437、ST15、ST23、ST147、ST439和ST1955各2株，ST17有1株。其中，33株ST11型菌株均攜帶有bla KPC-2 基因，其中1株ST11型攜帶兩種耐藥基因：bla KPC-2和bla IMP-4基因，另1株ST11型攜帶bla KPC-2和blaNDM-1基因。46株CRKP中，33株產KPC-2型碳青霉烯酶菌株為同一群，均為產KPC-2型碳青霉烯酶的ST11型，ST17型屬于一個群，而其余ST型屬于一群。

表2 46株測試菌的藥物敏感試驗結果分析[n(%)]

續表2 46株測試菌的藥物敏感試驗結果分析[n(%)]

3 討 論

3.1CRKP耐藥現狀嚴峻 CRKP的感染已成為院內感染死亡的獨立危險因素[2-4]，對其細菌特征和耐藥機制的研究顯得尤為重要。我國自連云港第一人民醫院2010年5月8日分離到第1株CRKP以來，CRKP分離率逐年上升，2015年CRKP分離率(22.37%)遠高于江蘇省(12.70%)和全國平均水平(7.60%)[5]。 不同地區不同醫院由于地域不同、用藥習慣的不同導致不同的耐藥趨勢出現，本研究收集到本院的46株測試菌株對頭孢類抗菌藥(除頭孢吡肟91.00%外)的耐藥率均為100.00%，亞胺培南耐藥率為100.00%，而美羅培南耐藥率為87.00%，中介率為13.00%，厄他培南耐藥率為76.00%，中介率為24.00%，3種碳青霉烯類藥物均處于中介耐藥水平(亞胺培南、美羅培南MIC 2.0～4.0 μg/mL或厄他培南MIC為≥2.0 μg/mL)，其他幾類抗菌藥(氨基糖苷類、喹諾酮類等)均表現為高耐藥性，這些菌株的出現對臨床治療選擇抗菌藥提出了極大挑戰。

3.2耐碳青霉烯酶表型確證試驗 實驗結果顯示，MHT檢測碳青霉烯酶陽性率為71.70%，而CIM在本次試驗中陽性率達到100.00%，可見該試驗用于檢測產碳青霉烯酶具有可靠性。而且2018年CLSI[13]已刪除了MHT作為確證試驗，該試驗主要是對A類碳青霉烯酶(尤其是KPC型)敏感度高，易漏檢其他類型。

3.3PCR擴增結果分析 46株CRKP菌株，經PCR擴增和測序結果顯示，有KPC-2、NDM-1和IMP-4 3種基因型的存在和流行，其中產KPC-2型碳青霉烯酶的ST11型為該院CRKP的主要型別，這與2017年中國上海報道的流行型別一致[6]。MLST分型同源性結果顯示有10株來自不同科室、不同時間的細菌進化來源相近，均屬于ST11型，為同一型別，說明院內可能出現耐藥菌株的傳播流行，臨床各科室和醫院感染控制部門也開始高度關注并采取有效的防控措施。

3.4MLST分型結果分析 研究結果顯示該院CRKP的耐藥機制以產KPC-2型碳青霉烯酶的ST11型菌株為主，同時存在其他碳青霉烯酶和ST型別。目前雖有超過115種ST型菌株中發現KPC酶[7]，而全球最主要型別為ST258和ST11，二者僅有一個管家基因tonB之差，中國地區以ST11為主要型別，歐美則以ST258型為主。研究顯示blaKPC基因多位于質粒上，這些質粒包括IncF(FIIk1、FIIk2和FIA),IncI2,IncX,IncA/C,IncR和ColE1[7]。有研究表明，blaKPC基因常存在于IncF型質粒[8-11]，質粒則主要通過轉座子Tn4401介導耐藥基因的傳播[12-15]，轉座子Tn4401攜帶KPC耐藥基因可插入不同質粒中并隨之水平轉移，導致耐藥基因的流行傳播，這是造成blaKPC基因流行的原因之一。

3.5不足與展望 由于實驗條件有限，本次研究設計的引物和測定方法可能不足以囊括所有該院的CRKP耐藥基因型導致尚有未檢出耐藥基因的菌株，也可能有新的基因型出現而未能發現，本課題組也會繼續監測耐藥菌株的變遷和耐藥機制的繼續深入研究，耐藥質粒的傳播機制等，以期能夠持續掌握本院的CRKP流行與耐藥機制，為臨床合理使用抗菌藥和加強院感監測提供科學、準確的實驗室依據。

4 結 論

本次實驗研究本院CRKP菌株的耐藥機制是以產KPC-2型碳青霉烯酶的ST11型為主，也是本院耐碳青霉烯腸桿菌科細菌的主要類型，并存在不同科室的克隆傳播，為醫院院內感染工作和感染防控提供科學依據，也提出問題，究竟存在哪種質粒的傳播，以及研究切斷質粒傳播途徑和運用轉座子特性研發阻斷途徑等控制耐藥菌株的流行分子學方法尤為迫切，也更加確證抗菌藥合理規范使用，從源頭上減少耐藥菌產生的重要性。另外，現行的院感防控措施是否行之有效，更全面的防控措施和更完善的消毒滅菌隔離等控制流行措施有待研究開發和有效運行。