外周血單個淋巴細胞遺傳分析及其在遺傳性疾病診斷中的應用*

李 丹，邱 萍，嚴愛貞，林炎鴻，曾 健，王志紅，蘭風華

(廈門大學附屬東方醫院全軍檢驗醫學研究所臨床遺傳與實驗醫學科，福建福州 350025)

單細胞研究于生物醫學研究領域有著重要的意義，其被列為未來最值得關注的研究領域之一。單細胞分離是實現單細胞研究的基礎，現有的分離技術有熒光激活細胞分選法、激光捕獲顯微切割、免疫磁珠法、微流控技術、連續稀釋分離法、顯微操作分離法等[1-2]。熒光激活細胞分選法、激光捕獲顯微切割、微流控技術等需依賴特殊的儀器，分選費用高，難以普及；連續稀釋分離法操作簡單，但大量存在的空白孔和多細胞孔需要研究人員觀察排除，費時費力。本研究結合稀釋法及體視鏡下可視化顯微操作，意在建立快速、簡易、準確的單細胞分離技術，并采用基于多重退火環狀循環擴增技術(MALBAC)[3]，旨在獲得高覆蓋度的單細胞全基因組擴增(WGA)產物，實現遺傳性疾病的診斷。

1 材料與方法

1.1材料 經廈門大學附屬東方醫院門診收集11例體檢健康者，β-珠蛋白生成障礙性貧血(β41-42M/βN型雜合突變個體)、法布里病(GLA基因第601位堿基由T突變為G，雜合突變個體)、先天性腎病綜合征(NPHS1基因第274位堿基由G突變為A，雜合突變個體)攜帶者(各1例，每例后續均進行3次單細胞WGA)乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝新鮮外周血。

1.2儀器與試劑 儀器：自制單細胞分離裝置；體視鏡(Leica)；細胞培養皿(BD Falcon)；PCR反應儀(珠海黑馬)；凝膠電泳儀、凝膠成像分析儀(北京六一)；臺式高速冷凍離心機(珠海黑馬)。試劑:淋巴細胞分離液(Axi-shield)；單細胞WGA試劑盒(江蘇億康)；PCR-反向點雜交試劑盒(亞能生物)；rTaq DNA聚合酶(Takara)。

1.3方法

1.3.1外周血淋巴細胞分離 外周血、PBS緩沖液等體積(均約2 mL，實驗所涉及的PBS不含Mg2+、Ca2+)混勻加入含3 mL淋巴細胞分離液于離心管內，2 000 r/min 20 ℃水平離心20 min，吸取分離液與血漿間的白膜層；吸取液內加入5 mL PBS緩沖液混勻，1 500 r/min 20 ℃水平離心10 min，棄上清液；加入2 mL紅細胞裂解液孵育5 min，500×g離心5 min，棄裂解液；加入5 mL PBS緩沖液，1 200 r/min 20 ℃離心10 min，棄上清液，重復操作1次；加入1 mL PBS緩沖液重懸，分離前后分別制備細胞涂片評估分離效果。

1.3.2單個淋巴細胞分離 細胞培養皿上加1 μL細胞重懸液，補PBS形成體積約7 μL的液滴。連于自制單細胞分離裝置的移液器，量程調至60 μL，在體視鏡下自液滴吸取100～200個細胞打至培養板空白位置，補PBS形成7 μL新液滴；自新液滴吸取10～50個細胞，打至新的位置并補加PBS，如此反復至每個體視鏡80倍視野僅可見2～3個細胞；將移液器量程調至30 μL，在鏡下緩慢吸取單個細胞，吸取到單個細胞后輕推可見單細胞從針口跳出，將單細胞吸回直接打入滅菌PCR反應管。

1.3.3單細胞WGA 采用億康MALBAC單細胞WGA試劑盒，嚴格按照說明書步驟操作，產物初定量及瓊脂糖凝膠電泳后行后續擴增。

1.3.4一代測序檢測目的基因 比較WGA產物及對應外周血DNA目的基因一代測序結果，探討本研究對遺傳疾病診斷的價值。所涉及的引物見表1。

表1 目的基因擴增所用引物序列

PCR體系如下：10×緩沖液2.5 μL，2.5 μmoL dNTP 0.8 μL，rTaq酶0.2 μL，模板1 μL，純水19.5 μL。反應條件：(1)變性95 ℃ 3 min。(2)擴增95 ℃ 30 s，相應的退火溫度30 s，72 ℃ 1 min，擴增重復35個循環(退火溫度：HBB 56 ℃；GLA 55 ℃；NPHS1 60 ℃)。HBB、GLA、NPHS1預計擴增片段長度分別為519 bp、433 bp、318 bp，瓊脂糖凝膠電泳出現清晰目的條帶的產物即送公司測序。

1.3.5PCR-反向點雜交法驗證 HBB基因雜合突變個體單細胞WGA產物行PCR-反向點雜交法探討本研究對β-珠蛋白生成障礙性貧血臨床常規診斷的價值，操作嚴格按照PCR-反向點雜交試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1外周血單個淋巴細胞的分離 淋巴細胞分離液處理前外周血白細胞以分葉核中性粒細胞為主，平均占比63%，分離后淋巴細胞平均占比94%，如圖1所示，分離效果良好。經紅細胞裂解液處理背景紅細胞未完全消失，但為了避免有核細胞的破壞，無需進一步處理少量存在的背景紅細胞。

注： A為處理前，以分葉核中性粒細胞為主；B為處理后，鏡下主要為淋巴細胞。

圖1 淋巴細胞分離液處理前后高倍鏡視野下細胞組成(×400倍，吉姆薩染色)

2.2單細胞WGA產物 單細胞WGA產物的核酸濃度波動于200～787 ng/μL，每個反應體系約67.9 μL，總核酸量均大于13 μg，初步純度測定A260/A280約為1.4。瓊脂糖凝膠電泳示所有樣本均擴增成功，產物的片段長度為250～2 000 bp，與說明書片段參考范圍基本一致。見圖2。

2.3目的基因的擴增成功率 以單細胞WGA產物為模板分別擴增目的基因HBB、GLA、NPHS1，瓊脂糖凝膠電泳示擴增成功率為100%，但某些樣本擴增時會出現非特異性條帶、目的條帶較淺的情況。見圖3、4。

注：M為DNA標記物；1、2、3、4：單細胞樣本；N為陰性對照；P為陽性對照。

圖2 部分樣本單細胞WGA電泳圖

2.4目的基因一代測序 健康者WGA產物目的基因測序結果與genebank登入的目的基因序列一致，攜帶者WGA產物目的基因測序則能夠準確顯示發生突變的位點，但與外周血DNA目的基因測序相比，單細胞WGA產物目的基因測序干擾較大，易引入突變。

2.5β-珠蛋白生成障礙性貧血PCR-反向點雜交 HBB基因發生CD41/42雜合突變的個體單細胞WGA產物除了利用一代測序進行珠蛋白生成障礙性貧血診斷準確性研究外，還利用PCR-反向點雜交探討了其對于β-珠蛋白生成障礙性貧血臨床常規診斷的價值，結果顯示WGA產物可應用于含CD41/42突變的β-珠蛋白生成障礙性貧血常規診斷。

注：M為DNA標記物；A、B、C分別代表HBB、GLA、NPHS1基因擴增情況；P為陽性對照；N為陰性對照；1～4為以WGA產物為模板的擴增。

圖3 部分健康對照人群單細胞WGA產物目的基因擴增情況

注：M為DNA標記物；A、B、C分別代表HBB、GLA、NPHS1基因擴增情況；P為陽性對照；N為陰性對照；1～2為以WGA產物為模板的擴增。

圖4 部分攜帶者單細胞WGA產物目的基因擴增情況

3 討 論

單細胞為生物體最基本的結構和功能單位，單細胞分析可以研究生物體的生長、發育、成熟過程[4-5]；打破傳統細胞生物學研究的局限，使細胞研究從群體水平向個體水平發展，揭示各組織細胞間異質性的存在[4,6-7]；單細胞WGA及高通量分析技術的發展則突顯了微量細胞如宮頸脫落滋養層細胞、母體循環胎兒細胞或者循環腫瘤細胞的臨床價值[8-11]；另外，單細胞分析在微生物研究中也發揮著重要作用[12]。

本研究利用單細胞分析實現了β-珠蛋白生成障礙性貧血、法布里病、先天性腎病綜合征的診斷。研究采用手工顯微操作分離單個淋巴細胞，該分離方法結合了連續稀釋法及顯微操作法，取材簡單，操作簡便、直觀可行，較連續稀釋法更能準確地分離出單個核細胞,且不需要特殊的儀器，易于普及。分離的單個淋巴細胞采用改良的WGA方法MALBAC進行擴增，該法擴增偏倚較傳統方法顯著降低，覆蓋度可達93%以上[3,13-14]。WGA產物目的基因的擴增成功率為100%，經測序鑒定可正確診斷疾病，還可用于β-珠蛋白生成障礙性貧血臨床常規診斷。

值得注意的是，某些WGA產物目的基因擴增中會引入非特異性條帶，猜想與樣本間WGA擴增質量的差別、模板純度低、無法準確統一模板量相關。另外，對目的基因測序中WGA產物的干擾要大于外周血DNA，且易于引入無關突變，可能與MALBAC所用的Taq聚合酶保真性不高相關[15]。為了提高對遺傳性疾病診斷的可靠性，研究中需進行以下改進：建立相應的方法評估單細胞WGA產物擴增質量，純化擴增產物保證模板質與量，多個單細胞WGA結合分析克服擴增方法固有缺陷，正反向測序分析相結合排除假突變。

4 結 論

本研究采用單細胞簡易手工顯微操作分離技術與單細胞WGA技術對外周血單個淋巴細胞行遺傳分析實現了3種遺傳病的準確診斷，為更多學者開展單細胞水平的遺傳研究如采用單個胎兒體細胞實現產前遺傳病診斷提供了思路，但研究還需改進以保證診斷的準確性。