柯薩奇病毒A組6型TaqMan一步法實時熒光定量PCR方法的建立*

劉紅波，叢山日，許丹菡，黃小琴，孫 浩，楊昭慶，馬紹輝△

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南昆明 650118;2.云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，云南昆明 650118)

自1998年以來，手足口病(HFMD)已成為全球重要的公共衛生問題[1]。與HFMD相關的病原體較為復雜，其中，以腸道病毒71型(EV-A71)和柯薩奇病毒A組16型(CV-A16)為主[2]。然而，從2008年起，與柯薩奇病毒A組6型(CV-A6)相關的HFMD病例在多個國家及我國許多地區被報道。并且，CV-A6病毒感染引起的HFMD具有非典型臨床癥狀，主要表現為非典型皰疹、甲狀腺腫、脫甲等，嚴重危害公眾健康[3-7]。因此，CV-A6病毒得到了我國疾病預防控制部門和醫療衛生機構的充分重視，被納入日常監測和臨床檢驗中。傳統檢測病毒的方法有病毒分離、生化、血清學診斷等，這些方法雖然可靠，但檢測周期長，操作復雜，不易快速得出結論。近年來發展起來的熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)，因其靈敏度、特異度、重復性好且操作簡便快速，被廣泛應用于病原體的定性定量檢測[8]。

1 材料與方法

1.1標本 CV-A6(KYN-A1205、YN-A13)、EV-A71、CV-A16和CV-A10毒株由本實驗室保存并提供，SPF級別實驗動物BALB/c孕鼠由本單位的小動物實驗部提供，實驗動物操作經中國醫學科學院醫學生物學研究所動物倫理委員會批準(批準編號：DWSP201804001)。

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀CFX96(BIORAD，美國)、病毒RNA提取試劑盒(Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit，美國)、病毒RNA擴增試劑盒(PrimescriptTMOne Step RT PCR Kit Ver.2)、瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒(E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit，美國)、加尾試劑盒(DNA A-Tailing Kit)、T載體(pMDTM18-T Vector Cloning Kit)、質粒DNA小量提取試劑盒(thermo scientificTM/GeneJET Plasmid Miniprep)、體外轉錄試劑盒(In vitro Transcription T7 Kit，for siRNA Synthesis)、核酸稀釋液(EASY Dilution，for Real Time PCR) 、一步法實時熒光定量PCR試劑盒(One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，for Perfect Real Time)等。

1.3引物和探針設計 從GenBank數據庫中下載15條CV-A6 VP1基因序列，利用MEGA7.0軟件比對后找出保守區域設計特異性引物(CV-A6-qP-F、CV-A6-qP-R)和Taqman探針(CV-A6-probe)，利用NCBI數據庫中Primer-BLAST檢測引物和探針的特異性。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，探針5′標記的熒光報告基團為FAM，3′標記的熒光淬滅基團為BHQ。

1.4陽性RNA標準品的建立 以本實驗室分離并鑒定為CV-A6的毒株KYN-A1205(基因登錄號：MN184853)作為模板，設計擴增引物CV-A6-VP1-F和CV-A6-VP1-R，其中上游引物包含T7啟動子，且該對引物包含CV-A6-qP-F、CV-A6-qP-R引物及CV-A6-probe。采用病毒RNA擴增試劑盒進行RT-PCR反應，陽性PCR產物經瓊脂糖凝膠試劑盒回收后利用DNA加尾試劑盒對其3′末端加“A尾”；與pMD18-T Vector連接并轉化DH5α感受態細胞，菌落PCR確定陽性克隆；利用質粒提取試劑盒提取質粒，送往碩擎(昆明)生物技術有限公司并用pMD18-T Vector通用引物M13F和M13R測序確定目的片段插入的方向；Sal I限制性內切酶將重組質粒線性化后切膠回收；體外轉錄試劑盒轉錄出目的RNA，并用紫外分光光度計測定其水平；根據公式計算拷貝數：單位體積RNA拷貝數(copy/mL)=6.02×1023×(X g/mL)/(RNA堿基數×340)，RNA于-20 ℃保存備用。其中，本實驗所用到的引物和探針序列見表1。

表1 引物和探針序列

注：下劃線序列為T7啟動子序列。

1.5RT-qPCR方法的建立 反應體系(20 μL)： 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ緩沖液10 μL，TaKaRa Ex Taq HS(5 U/μL)為0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ為0.4 μL，CV-A6-Probe(10 μmol/L)為0.8 μL，CV-A6-qP-F(10 μmol/L)為0.4 μL，CV-A6-qP-R(10 μmol/L)為0.4 μL,RNA模板為1 μL，RNase Free H2O為6.6 μL，其中引物和探針水平為試劑盒推薦的最佳濃度。按照說明書設置反應條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，另95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s共40 個循環。

1.6靈敏度試驗 根據上述RNA拷貝數計算公式，用核酸稀釋液EASY Dilution(for Real Time PCR)將RNA標準品稀釋至初始濃度834 ng/μL(對應拷貝數為1012copy/μL)，連續10倍梯度稀釋，從1011～100copy/μL，并設置無模板對照(NTC)，按照上述反應體系及反應條件進行一步法RT-qPCR，從而確定檢測最低拷貝數的極限。為了評估該標準品的重復性和穩定性，每個稀釋度設置3個復孔。選取上述9個稀釋度(103～1011copy/μL)對應拷貝數的對數和循環閾值Ct值，系統自動生成標準曲線。

1.7特異度試驗 對EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10核酸進行檢測以評估該方法的特異度。

1.8乳鼠組織病毒載量檢測 毒株YN-A13感染1日齡BALB/c乳鼠后解剖取心、肝、脾、肺、腎、腸、腦組織并提取RNA，按照上述反應體系及反應條件進行一步法RT-qPCR，反應結束后根據Ct值和標準曲線公式計算出各組織中的病毒載量。

2 結 果

2.1陽性RNA標準品的建立 經RNA拷貝數公式計算得出，當RNA標準品稀釋至初始濃度為834 ng/μL 時，其對應拷貝數為1012copy/μL(RNA標準品長度為1 477 nt)。

2.2實驗的靈敏度 經檢測，RNA標準品在102～1011copy/μL范圍內出現良好的擴增曲線,見圖1A。當模板為102copy/μL時，Ct值為35.8，從而認為該方法的檢測極限約為102copy/μL。RNA標準品在103～1011copy/μL的范圍內具有良好的線性關系，見圖1B(R2系數為0.999，擴增效率為109.6%，方程式為Y=-3.112X+43.149)。

注：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J分別代表1011、1010、109、108、107、106、105、104、103、102copy/μL RNA樣品;A為擴增曲線;B為標準曲線。

圖1 不同稀釋度的擴增曲線

2.3重復性試驗 在本研究中，對102～1011copy/μL范圍內的9個稀釋度的樣品各進行3次組內重復性試驗，并對試驗結果進行統計分析。利用軟件SPSS19.0計算出組內熒光定量中Ct值及R2的值的變異系數(CV)，見表2。

表2 RT-qPCR 組內重復性試驗

2.4特異度試驗 利用該方法檢測EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10病毒核酸時，僅有CV-A6出現陽性擴增曲線，其余病毒及NTC檢測結果均為陰性，見圖2。

圖2 RT-qPCR的特異度試驗

2.5乳鼠組織病毒載量檢測結果 用該方法檢測YN-A13毒株感染1日齡BALB/c乳鼠后各組織中CV-A6的載量。其中，各樣本均出現良好的擴增曲線見圖3A。Ct值在18.98～34.46，根據各樣本達到熒光閾值對應的Ct 值和標準曲線的公式可精確計算出各組織中CV-A6病毒的載量，見圖3B。

注：A為乳鼠各組織及標準品各稀釋度擴增曲線;B為乳鼠各組織病毒載量。

圖3 乳鼠組織病毒載量檢測結果

3 討 論

CV-A6為單股正鏈的小RNA病毒，作為近十年來引起HFMD的主要病原體之一，嚴重危害兒童的健康[9]。CV-A6感染可引起全身性水皰疹、侵蝕性皮疹和紫癜損傷等非典型HFMD臨床癥狀，部分CV-A6感染可導致無菌性腦膜炎和腦干腦炎等嚴重疾病[10-11]。而且CV-A6感染容易與其他出疹性疾病，如水痘、麻疹等混淆，致使臨床醫生發生漏診甚至誤診的情況。因此，建立一種快速準確檢測CV-A6感染的方法，為CV-A6的流行病學調查和實驗室診斷均提供了可靠的檢測技術。

傳統檢測CV-A6的方法以病毒分離培養和血清學診斷為主[12]。病毒分離作為病毒性疾病診斷的金標準，常采用細胞培養對臨床樣品進行病毒分離。雖然，該方法特異度強，但培養周期過長，分離率低，因而，常被用于回顧性診斷。血清學診斷技術也伴有周期長和靈敏度低等缺點。另外，目前實驗室常用的普通RT-PCR特異度雖強，但易污染且只能進行定性分析[13]。

CV-A6病毒與其他腸道病毒結構類似，其中VP1基因相對保守，常被用作病毒血清型鑒定以及進化分析的靶基因。本研究選擇CV-A6的VP1基因比對后的保守區域設計引物和探針，構建一步法RT-qPCR檢測方法，為進一步提高引物和探針與靶基因結合位點的保守性。另外，TaqMan探針與模板特異度互補，極大提高了反應的特異度。利用該方法檢測EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10病毒核酸時，僅有CV-A6核酸出現擴增曲線，進一步提示該方法具有較強的特異度。經檢測，該方法在102～1011copy/μL模板范圍內，均具有良好的擴增曲線，提示該方法在很大的線性范圍內可對病毒核酸進行檢測和定量分析。再者，通過對該方法的重復性進行分析發現，組內CV值在0.20%～1.01%，小于2.00%，說明其重復性良好[14]。利用該方法檢測感染CV-A6后BALB/c乳鼠組織的病毒載量，發現各樣本均出現良好的擴增曲線，根據Ct值和標準曲線的公式可精確計算出各組織中初始病毒量。

另外，與李洋等[15]建立的CV-A6 TaqMan探針RT-qPCR檢測方法不同的是，本研究將構建好的重組質粒進一步線性化，并通過體外轉錄獲得RNA為標準品。在檢測反應體系中，RNA標準品與待檢測的樣品同步進行，一步法完成逆轉錄及qPCR的過程，保證了每個樣品的擴增效率一致，對病毒進行定量時也盡可能地降低了試驗誤差。并且，在1 h內可以同步完成96孔樣品的擴增及檢測，RT-qPCR產物無需凝膠電泳檢測和測序分析，極大地節約了時間和成本。當然，該檢測方法也存在一些不足，例如無法檢測擴增片段的大小以及各個實驗室構建的標準品有所不同導致實驗結果缺乏可比性，但相信隨著科技的發展，這些問題終將被突破。

4 結 論

本研究成功構建了用于檢測CV-A6并能對病毒精準定量的方法，為CV-A6的流行病學調查和預防帶來了幫助。本檢測方法特異度強，靈敏度高，重復性好，能夠可靠地應用于CV-A6的檢測。